P38MAPK通過調(diào)制GLT-1參與肢體缺血預(yù)處理誘導的缺血耐受.pdf

1、目的:目前,缺血性腦病的發(fā)病率在全球不斷上升,形勢也日益嚴峻。多年來,許多研究人員致力于研究腦缺血耐受機體的內(nèi)源性保護機制,以期提高神經(jīng)細胞對缺血性損害的抵抗力,使其在遭受較嚴重的缺血打擊后仍保持存活,并在恢復供血后仍具有正常的生理功能。
　　 我室既往研究證實,反復3次股動脈夾閉和再灌的肢體缺血預(yù)處理(limb ischemic preconditioning,LIP)可減輕隨后即刻發(fā)生的腦缺血再灌注引起的大鼠海馬CA1區(qū)錐體

2、神經(jīng)元延遲性死亡和凋亡、誘導腦缺血耐受,證實了遠隔器官缺血預(yù)處理對腦的保護作用。雖然腦缺血的發(fā)生無法預(yù)測,但是在心肺分流術(shù)等一些發(fā)生腦缺血危險幾率較高的手術(shù)中,全腦缺血性損傷是可以預(yù)知的。如果能在損傷發(fā)生之前就施予干預(yù)措施,無疑具有重要的現(xiàn)實意義。因此,探討LIP腦保護作用的機制可為開發(fā)神經(jīng)保護藥物或方法提供新的思路。
　　 MAPK是細胞內(nèi)的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,在哺乳類細胞目前已發(fā)現(xiàn)存在著下述三條并行的MAPKs信號通

3、路:ERK、JNK和p38MAPK通路。我室既往采用免疫組織化學、硫堇染色以及Westernblot等方法研究證實,p38MAPK參與了LIP誘導的大鼠腦缺血耐受,并且在這一過程中上調(diào)了HSP70的表達、抑制了凋亡通路、改變了超氧化物歧化酶的活性。但是,p38MAPK的神經(jīng)保護機制尚不完全清楚。
　　 谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì),但過高濃度的谷氨酸又具有極強的神經(jīng)毒性。腦缺血時,細胞外液中谷氨酸等興奮性氨基酸濃度

4、異常升高,通過鈣超載、干擾能量代謝等導致細胞損傷。細胞外谷氨酸清除的主要途徑是興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運體(excitatory amino transporters,EAATs)攝取谷氨酸。目前已發(fā)現(xiàn)五種高親和力谷氨酸轉(zhuǎn)運體:GLAST(EAAT1)、GLT-1(EAAT2)、EAAC1(EAAT3)、EAAT4和EAAT5。研究證實,GLT-1在防止其興奮性毒性作用方面發(fā)揮著更為重要的作用。因此,對GLT-1進行調(diào)制,增強其對細胞外液中谷氨酸

5、的攝取以及防止其出現(xiàn)逆向轉(zhuǎn)運,是防止腦缺血時細胞外液中谷氨酸濃度異常升高及其神經(jīng)毒性作用的有效方法。我室研究發(fā)現(xiàn),腦缺血預(yù)處理可抑制全腦缺血打擊引起的海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元的延遲性死亡,同時可上調(diào)海馬CA1區(qū)GLT-1的表達,抑制腦缺血引起的細胞外液中谷氨酸濃度的升高;而應(yīng)用GLT-1特異性抑制劑DHK或GLT-1反義寡聚脫氧核苷酸后,均能劑量依賴性的阻斷腦缺血預(yù)處理對全腦缺血大鼠的神經(jīng)保護作用,提示GLT-1參與了腦缺血預(yù)處理誘導的腦

6、缺血耐受。
　　 那么,LIP誘導的腦缺血耐受是否有GLT-1的參與呢？如果有,GLT-1與我們先前研究的p38MAPK之間是否有級聯(lián)關(guān)系？實際上,既往文獻中有關(guān)p38MAPK對GLT-1調(diào)制作用的研究已有報道。2009年,Tsai等在百日咳毒素致熱痛覺過敏大鼠模型中發(fā)現(xiàn),p38MAPK特異性抑制劑SB203580能減輕此種痛敏反應(yīng)、增加腦脊液中興奮性氨基酸、下調(diào)谷氨酸轉(zhuǎn)運體的表達。此外,Matos等在阿耳茨海默氏病的研究中證實

7、,SB203580能夠下調(diào)星形膠質(zhì)細胞中GLT-1的表達。我室在近期的工作中,也證實了p38MAPK通過調(diào)制GLT-1在腦缺血預(yù)處理誘導的腦缺血耐受中發(fā)揮了重要作用。
　　 因此,本研究的目的在于:①觀察LIP不同時間窗對腦缺血再灌注損傷的影響,并應(yīng)用GLT-1特異性抑制劑DHK,觀察抑制GLT-1表達對LIP誘導的腦缺血耐受的影響;②觀察并比較LIP后大鼠海馬CA1區(qū)p38MAPK和GLT-1表達的時間過程;③應(yīng)用p38MAP

8、K抑制劑SB203580,觀察抑制p38MAPK后,大鼠海馬CA1區(qū)GLT-1表達的變化。通過上述研究,探討p38MAPK是否通過調(diào)制GLT-1參與肢體缺血預(yù)處理誘導的腦缺血耐受,為腦缺血性疾病的防治提供新的思路。
　　 1、LIP減輕大鼠全腦缺血再灌注引起的海馬CA1區(qū)遲發(fā)性神經(jīng)元死亡及GLT-1在此過程中的作用
　　 1.1、觀察LIP不同時間窗對腦缺血再灌注損傷的影響
　　 50只Wistar大鼠永久凝閉雙

9、側(cè)椎動脈恢復兩天后,隨機分為四組:①全腦缺血的sham組(n=5):暴露雙側(cè)頸總動脈8min,但不阻斷血流;②全腦缺血組(n=5):夾閉雙側(cè)頸總動脈8min后恢復再灌注;③LIP+全腦缺血組(n=35):夾閉雙側(cè)股動脈10min、再灌流10min,反復3次,之后行8min全腦缺血,根據(jù)LIP與全腦缺血間隔時間不同分為LIP0h、LIP1h、LIP3h、LIP6h、LIP12h、LIP1d和LIP2d組;④LIP的sham+全腦缺血組(n

10、=5):根據(jù)③中結(jié)果選擇腦保護效果最好的時間點,即暴露雙側(cè)股動脈后即刻(LIP0h組)行8min全腦缺血。以上各組大鼠在sham手術(shù)或末次缺血再灌后7d斷頭取腦,冠狀切片后分別進行硫堇染色和HE染色。低倍鏡下觀察硫堇染色的海馬組織形態(tài),參照Kitagawa(1990)和Kato(1991)分級方法,對海馬CA1區(qū)確定組織學分級(histologicalgrade,HG),標準如下:0級:無神經(jīng)元死亡;Ⅰ:散在神經(jīng)元死亡;Ⅱ級:成片神經(jīng)元

11、死亡;Ⅲ級:幾乎全部神經(jīng)元死亡。高倍鏡計數(shù)雙側(cè)海馬CA1區(qū)每1mm區(qū)段內(nèi)細胞膜完整、胞核飽滿、核仁清晰的錐體細胞數(shù)目,每張切片雙側(cè)海馬各計數(shù)3個區(qū)段,取平均數(shù)作為神經(jīng)元密度(neuronal density,ND)。HE染色觀察膠質(zhì)細胞的變化。
　　 硫堇染色結(jié)果顯示,全腦缺血的sham組大鼠海馬CA1區(qū)錐體細胞排列整齊、致密,為2～3層,無細胞缺失,細胞形態(tài)完整、邊界清晰,胞核飽滿、核仁深染、清晰,無明顯的延遲性神經(jīng)元死亡(d

12、elayed neuronal death,DND),HG為0級,ND值為167±5.21(cells/mm,下同)。全腦缺血組與LIP的sham+全腦缺血組大鼠海馬CA1區(qū)有明顯的組織學損傷,出現(xiàn)嚴重的DND,錐體細胞形態(tài)改變明顯,幾乎全部神經(jīng)元死亡或缺失,HG均為Ⅲ級,ND值分別為36±9.28、35±5.93,與全腦缺血的sham組相比,HG明顯升高(P＜0.01),ND值明顯降低(P＜0.01)。然而,LIP+全腦缺血組大鼠在0

13、h,1h,3h,6h各時間點海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元均未見明顯損傷,尤其是LIP0h組錐體細胞排列整齊,僅個別錐體細胞胞核固縮,無明顯細胞缺失,與LIP的sham組相比,HG(0～Ⅰ)明顯降低、ND值(154±5.93)明顯升高(P＜0.05)。然而在LIP12h、LIP1d和LIP2d組,錐體神經(jīng)元細胞缺失較多,發(fā)生嚴重的DND,與LIP的sham組比較,HG(Ⅱ～Ⅲ)及ND值(分別為46±7.66、40±7.69和42±10.80)均

14、無顯著性差別。這些結(jié)果表明,LIP對即刻(0h)、1h、3h和6h后發(fā)生的腦缺血再灌注損傷有明顯的對抗作用,且以LIP后即刻最為明顯,從而減輕了大鼠全腦缺血再灌注引起的海馬CA1區(qū)遲發(fā)性神經(jīng)元死亡。
　　 HE染色結(jié)果顯示,全腦缺血的sham組大鼠海馬CA1區(qū)錐體細胞排列整齊、致密,為2～3層,細胞形態(tài)正常,核仁清晰,胞核圓而大,染色淺呈藍色,胞漿呈淡紅色。絕大多數(shù)小膠質(zhì)細胞處于未激活狀態(tài),細胞呈長形,細胞核為三角形。全腦缺血組

15、與LIP的sham組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元發(fā)生變性、壞死,細胞固縮、核膜消失,細胞核碎裂、溶解,染色較深。小膠質(zhì)細胞增生,細胞從長形變成圓形,胞漿變豐富。大量凋亡細胞的核染色質(zhì)致密深染。LIP+全腦缺血組大鼠在0h、1h、3h和6h各時間點海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元均未見明顯損傷,細胞大小形態(tài)正常,染色較均勻。小膠質(zhì)細胞未激活,核膜清晰、染色較淺。然而,在LIP12h、LIP1d和LIP2d組錐體神經(jīng)元細胞損傷明顯,細胞核有不同程度的碎裂、

16、溶解,隨著時間延長損傷加重,染色加深。上述結(jié)果表明,大鼠在腦缺血過程中產(chǎn)生了炎癥反應(yīng),而LIP即刻(0h)、LIP1h、LIP3h和LIP6h組對之后發(fā)生的腦缺血引起的炎癥反應(yīng)有明顯的減緩作用,并且以LIP即刻組最為明顯。
　　 1.2、應(yīng)用GLT-1抑制劑DHK抑制GLT-1的功能,觀察對LIP腦保護作用的影響
　　 50只Wistar大鼠永久凝閉雙側(cè)椎動脈恢復兩天后,隨機分為7組:①全腦缺血的sham組(n=5):暴

17、露雙側(cè)頸總動脈8min,但不阻斷血流;②全腦缺血組(n=5):夾閉雙側(cè)頸總動脈8min后恢復再灌注;③LIP的sham組+全腦缺血(n=5):暴露雙側(cè)股動脈50min后,夾閉雙側(cè)頸總動脈8min后恢復再灌注;④LIP+全腦缺血組(n=5):夾閉雙側(cè)股動脈10min、再灌流10min,反復3次,即刻夾閉雙側(cè)頸總動脈8min后恢復再灌注;⑤人工腦脊液(artificial cerebrospinal fluid,ACSF)組(n=5):右側(cè)

18、腦室注射ACSF20μl;⑥D(zhuǎn)HK+LIP+全腦缺血組(n=20):右側(cè)腦室注射DHK溶液20μl,30min后夾閉雙側(cè)股動脈10min、再灌流10min,反復3次,即刻夾閉雙側(cè)頸總動脈8min后恢復再灌注,根據(jù)DHK的劑量進一步分為10nmol、100nmol、200nmol和400nmol亞組;⑦DHK組(n=5):右側(cè)腦室注射DHK溶液20μl,30min后夾閉雙側(cè)股動脈10min、再灌流10min,反復3次,DHK的劑量根據(jù)⑥中

19、結(jié)果選取抑制效果最佳的一組。以上各組大鼠均于末次操作后7d后斷頭取腦,切片行硫堇染色,在光學顯微鏡下觀察海馬CA1區(qū)的遲發(fā)性神經(jīng)元死亡情況,確定病理學分級,并計數(shù)神經(jīng)元密度(標準同上)。觀察GLT-1的特異性抑制劑DHK對LIP誘導腦缺血耐受的影響。
　　 硫堇染色結(jié)果顯示,全腦缺血的sham組大鼠海馬CA1區(qū)無明顯的DND,HG為0級,ND值為181±8.29。全腦缺血組大鼠海馬CA1區(qū)出現(xiàn)明顯的DND,與全腦缺血的sham組

20、相比,HG(Ⅲ級)明顯升高(P＜0.01),ND值(27±8.64)顯著降低(P＜0.01)。LIP+全腦缺血組海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元無明顯損傷,與全腦缺血組相比,HG(0～Ⅰ級)明顯降低(P＜0.01),ND值(174±12.77)顯著升高(P＜0.01),表明LIP可以誘導大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元產(chǎn)生缺血性耐受。右側(cè)腦室注射ACSF后,大鼠海馬CA1區(qū)組織形態(tài)與LIP+全腦缺血組基本一致,無統(tǒng)計學差異。在DHK+LIP+全腦缺血組,大

21、鼠海馬CA1區(qū)出現(xiàn)顯著的DND,并且隨著DHK劑量的增加,其HG逐漸升高,10nmol組和100nmol組為Ⅰ～Ⅱ級,200nmol組為Ⅱ～Ⅲ級,400nmol組為Ⅲ級;ND逐漸下降,分別為121±10.91、82±10.35、16±5.71和8±6.04。然而,單純右側(cè)腦室給予DHK200nmol對海馬CA1區(qū)HG(0～Ⅰ級)和ND值(158±11.31)均無明顯影響,提示DHK無明顯的神經(jīng)元毒性作用。以上結(jié)果表明,GLT-1特異性抑

22、制劑DHK可劑量依賴性地阻斷LIP的神經(jīng)保護作用。
　　 2、P38MAPK是否通過調(diào)制GLT-1參與LIP誘導的腦缺血耐受
　　 2.1、LIP對大鼠海馬CA1區(qū)p-p38MAPK和GLT-1表達的影響
　　 110只Wistar大鼠除Control組外其余大鼠均永久凝閉雙側(cè)椎動脈后恢復兩天:①Control組(n=10):不做任何處理;②LIP+全腦缺血組(n=100):夾閉雙側(cè)股動脈10min、再灌注10m

23、in、反復3次,即刻夾閉雙側(cè)頸總動脈8min,然后恢復再灌注。以上各組大鼠均于末次操作后0h、30min、1h、3h、6h、12h、1d、3d、5d、7d斷頭取腦,各組各時間點分別取5只用于免疫組織化學、其余5只用于Western blotting檢測大鼠海馬CA1區(qū)p-p38MAPK和GLT-1的表達,并比較其時間關(guān)系。
　　 GLT-1的免疫組化結(jié)果顯示,control組海馬CA1區(qū)未見明顯的GLT-1表達,染色較淺,平均光

24、密度和陽性細胞總面積分別為2.66±0.71和5035.02±1087(μm2,下同)。LIP+全腦缺血后各時間點海馬CAI區(qū)GLT-1的表達均有不同程度的上調(diào),在錐體細胞周圍形成一定的“網(wǎng)格”狀。在LIP+全腦缺血后即刻(0h)、30min、1h、3h和6h時間點平均光密度和總面積均有所增加,著色逐漸加深,但與control組相比無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。而LIP+全腦缺血后12h、1d、3d時間點海馬CAI區(qū)GLT-1的表達明顯

25、增多,以1d時間點最為明顯,染色比較深,星型細胞及其突起出現(xiàn)強的點狀、條狀陽性標記,其平均光密度和陽性細胞總面積分別10.81±0.93和21351.19±2025,與control組相比有統(tǒng)計學差異(P＜0.01)。LIP+全腦缺血5d、7d時間點海馬CA1區(qū)GLT-1的表達逐漸減少,染色逐漸變淺,與control組相比無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。P-p38MAPK的免疫組化結(jié)果顯示,control組海馬CA1區(qū)中未見明顯的p-p3

26、8MAPK陽性表達,染色較淺,平均光密度和陽性細胞總面積分別為1.65±0.28和5486.19±3596(μm2,下同)。LIP+全腦腦缺血后各時間點海馬CA(Ⅰ)區(qū)神經(jīng)元中p-p38MAPK的表達均有不同程度的上調(diào),即刻時間點陽性細胞表達量較少,胞核著色淺。在LIP+全腦缺血30min、1h、3h時間點,陽性細胞平均光密度和總面積均有所增加,但與control組相比無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。然而,LIP+全腦缺血6h、12h和1

27、d時間點海馬CA(Ⅰ)區(qū)p-p38MAPK的表達明顯增多,以12h最為明顯,胞核著色明顯加深,呈深棕黃色,其平均光密度和陽性細胞總面積分別9.22±0.87和49762.16±7799,與control組相比有統(tǒng)計學差異(P＜0.01)。LIP+全腦缺血3d時間點p-p38MAPK的表達開始減低,LIP+全腦缺血5d、7d時胞核著色明顯變淺,與control組相比無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。
　　 Western blot結(jié)果

28、顯示,control組海馬CA1區(qū)GLT-1的表達量極低。LIP+全腦缺血后各時間點中GLT-1的表達均有不同程度上調(diào)。其中LIP+全腦缺血后即刻(0h)、30min、1h、3h和6h時間點與control組相比無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。從LIP+全腦缺血12h開始,GLT-1的表達明顯增多,1d達到高峰,持續(xù)到3d,與control組相比有統(tǒng)計學差異(P＜0.01)。LIP+全腦缺血5d后GLT-1的表達開始降低,7d時基本降到即

29、刻水平。control組海馬CA1區(qū)p-p38MAPK的表達量很少。LIP+全腦缺血后各時間點中p-p38MAPK的表達有不同程度增多,但是即刻(0h)、30min、1h、3h時間點與control組相比無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。從6h開始p-p38MAPK的表達明顯增多,12h達到高峰,并持續(xù)到1d左右,與control組相比有統(tǒng)計學差異(P＜0.01)。LIP+全腦缺血3d后p-p38MAPK的表達開始下降,持續(xù)到7d時降至起始

30、水平。
　　 以上結(jié)果表明:LIP能夠上調(diào)腦缺血大鼠海馬CA1區(qū)p-p38MAPK和GLT-1的表達,且p-p38MAPK表達上調(diào)開始時間和表達高峰時間均早于GLT-1。
　　 2.2、應(yīng)用p38MAPK抑制劑抑制p38MAPK后,觀察大鼠海馬CA1區(qū)GLT-1表達的變化
　　 40只Wistar大鼠永久凝閉雙側(cè)椎動脈恢復兩天后,隨機分為五組:①LIP+全腦缺血組(n=5):夾閉雙側(cè)股動脈10min、再灌注10m

31、in、反復3次,即刻夾閉雙側(cè)頸總動脈8min,然后恢復再灌注。②DMSO+LIP+全腦缺血組(n=5):右側(cè)腦室注射DMSO溶液25μl,30min后夾閉雙側(cè)股動脈10min、再灌流10min,反復3次,即刻夾閉雙側(cè)頸總動脈8min后恢復再灌注;③SB203580+LIP+全腦缺血組(n=20):右側(cè)腦室注射SB203580溶液25μl,30min后夾閉雙側(cè)股動脈10min、再灌流10min,反復3次,即刻夾閉雙側(cè)頸總動脈8min后恢復

32、再灌注,根據(jù)SB203580的劑量進一步分為50μmol、100μmol、200μmol和400μmol四個亞組;④SB203580的sham組(n=5):右側(cè)腦室注射SB203580溶液25μl(400μmol)。⑤全腦缺血的sham組(n=5):暴露雙側(cè)頸總動脈8min,但不阻斷血流。以上各組大鼠均于末次操作后1d(根據(jù)2.1中結(jié)果,選取GLT-1的表達高峰時間點)斷頭取腦,免疫組織化學檢測海馬CA1區(qū)GLT-1的表達。
　　

33、 免疫組化結(jié)果顯示,全腦缺血的sham組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元內(nèi)有少量GLT-1的表達,染色淺,彌散性分布,平均光密度和陽性細胞總面積分別為6.17±0.6和11394.17±1225(μm2,下同)。SB203580的sham組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元內(nèi)GLT-1的表達也較少,與全腦缺血的sham組相比無顯著差異(P＞0.05),平均光密度和陽性細胞總面積分別為5.85±0.9和10984.5±1185。提示抑制劑SB203580無明顯的神經(jīng)

34、元毒性作用。LIP+全腦缺血組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元GLT-1的表達明顯上調(diào),染色較深,為深棕黃色,星型膠質(zhì)細胞及其突起出現(xiàn)強的點狀、條狀陽性標記,其平均光密度和陽性細胞總面積分別為10.74±0.85、19951.19±1508。SB203580+LIP+全腦缺血組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元中GLT-1的表達明顯降低,隨著劑量的加大降低更加明顯。與LIP+全腦缺血組相比,平均光密度顯著降低(P＜0.01),分別為4.03±0.55、2.84±0.

35、54、2.46±0.5、2.38±0.31。陽性細胞總面積也明顯降低(P＜0.01),分別為9645.17±1140、8032.16±1197、6844.36±929、5780.43±939。DMSO+LIP+全腦缺血組GLT-1陽性細胞表達比較多,與LIP+全腦缺血組相比,平均光密度和陽性細胞總面積均無顯著差異(P＞0.05),分別為9.04±0.96、18339.8±1103。以上結(jié)果表明,p38MAPK的特異性抑制劑SB20358

36、0能劑量依賴性的阻斷LIP誘導的腦缺血耐受過程中GLT-1表達的上調(diào)。
　　 結(jié)論:
　　 1、LIP不同時間窗可減輕隨后發(fā)生的腦缺血再灌注引起的海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元的延遲性死亡,其中以LIP后即刻(0h)作用最為顯著。
　　 GLT-1特異性抑制劑DHK可劑量依賴性地阻斷LIP抗腦缺血打擊的作用,表明GLT-1促進了LIP誘導的大鼠腦缺血耐受。
　　 2、LIP能夠上調(diào)大鼠海馬CA1區(qū)p-p38MAP