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文檔簡(jiǎn)介
1、目的:腦缺血性疾病具有發(fā)病率、致殘率、死亡率高,知曉率、治療率、控制率低等特點(diǎn),嚴(yán)重威脅著人類的生命健康。且隨著我國(guó)老齡化社會(huì)的到來(lái),此類疾病的嚴(yán)峻形勢(shì)不容忽視。近年來(lái),許多科研人員致力于調(diào)動(dòng)機(jī)體內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制以提高腦神經(jīng)細(xì)胞對(duì)缺血性損害的抵抗力的研究,使其在遭受嚴(yán)重的缺血打擊并恢復(fù)血液灌流后仍具有正常的生理功能,為此類疾病的防治提供新思路。
自1990年日本學(xué)者Kitagawa發(fā)現(xiàn)腦缺血預(yù)處理現(xiàn)象以來(lái),大量研究證實(shí)了同一器官
2、缺血預(yù)處理所帶來(lái)的保護(hù)作用。盡管腦缺血預(yù)處理誘導(dǎo)的腦缺血耐受具有強(qiáng)大的內(nèi)源性保護(hù)作用,然而對(duì)中樞器官進(jìn)行缺血預(yù)處理,很難作為一種腦缺血前的預(yù)防措施直接應(yīng)用于臨床。隨著對(duì)缺血預(yù)處理研究的進(jìn)一步深入,許多研究者發(fā)現(xiàn)并證實(shí)了遠(yuǎn)隔器官缺血預(yù)處理的保護(hù)作用。遠(yuǎn)隔器官缺血預(yù)處理是指預(yù)先對(duì)靶器官以外的組織或器官進(jìn)行缺血預(yù)處理,使靶器官產(chǎn)生缺血耐受的現(xiàn)象。這一發(fā)現(xiàn)實(shí)現(xiàn)了采用非重要生命器官缺血預(yù)處理對(duì)抗重要生命器官的缺血再灌注損傷,具有更好的可操作性與安
3、全性。
我們近些年的研究證實(shí),反復(fù)3次雙側(cè)股動(dòng)脈夾閉和開(kāi)放的肢體缺血預(yù)處理(limb ischemic preconditioning,LIP)可減輕隨后即刻發(fā)生的腦缺血再灌注引起的大鼠海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元的延遲性死亡和凋亡、誘導(dǎo)腦缺血耐受。隨后,我們?cè)谶M(jìn)一步的研究中發(fā)現(xiàn)LIP可通過(guò)上調(diào)大鼠海馬CA1區(qū)p38 MAPK、ERK、HSP70以及Ngb等的表達(dá),抑制凋亡通路,改變SOD活性等途徑,誘導(dǎo)大鼠腦缺血耐受。然而,缺血預(yù)
4、處理的肢體與遭受缺血打擊的大腦相隔較遠(yuǎn),由LIP啟動(dòng)的內(nèi)源性保護(hù)信號(hào)如何作用于腦,其機(jī)制尚不完全清楚。2009年,加拿大學(xué)者Shimizu等在家兔離體心臟和心肌癥模型中發(fā)現(xiàn),將LIP誘導(dǎo)的心肌缺血耐受的家兔血漿和血漿透析液給予單純心肌缺血的家兔,同樣可以保護(hù)受損的心肌,這說(shuō)明LIP可通過(guò)體液途徑發(fā)揮遠(yuǎn)隔器官或組織的保護(hù)作用。隨著研究的進(jìn)一步深入,后來(lái)人們又發(fā)現(xiàn)了自由基、腺苷等體液因子參與了此過(guò)程:在脊髓的缺血再灌注損傷模型中,于LIP前
5、靜脈內(nèi)給予自由基清除劑DMTU能逆轉(zhuǎn)LIP的脊髓保護(hù)作用,提示LIP可通過(guò)自由基發(fā)揮保護(hù)作用;2014年,Montero等研究發(fā)現(xiàn),在小腸缺血再灌注損傷模型中,靜脈給予腺苷可減輕由小腸缺血再灌注所繼發(fā)的心臟損害,提示腺苷發(fā)揮了遠(yuǎn)隔器官的保護(hù)作用。那么,LIP能否通過(guò)體液因子腺苷及自由基誘導(dǎo)腦缺血耐受?同時(shí)這些體液因子是否能上調(diào)此過(guò)程中p38 MAPK和ERK的表達(dá)呢?
因此,本課題的研究目的在于:①自由基及腺苷在LIP誘導(dǎo)的大
6、鼠腦缺血耐受中的作用;②自由基及腺苷在LIP誘導(dǎo)的大鼠海馬CA1區(qū)p38 MAPK和ERK表達(dá)上調(diào)中的作用。通過(guò)對(duì)上述問(wèn)題的研究,以期為L(zhǎng)IP的腦保護(hù)作用提供充實(shí)的實(shí)驗(yàn)依據(jù),有助于更全面地認(rèn)識(shí)LIP腦保護(hù)作用的機(jī)制。
方法與結(jié)果:
1、自由基及腺苷在LIP誘導(dǎo)的大鼠腦缺血耐受中的作用
1.1自由基清除劑DMTU對(duì)LIP誘導(dǎo)的大鼠腦缺血耐受的影響
動(dòng)物分組:雄性Wistar大鼠80只,永久凝閉雙側(cè)椎
7、動(dòng)脈后恢復(fù)兩天,隨機(jī)分為以下5組:①全腦缺血的sham組(n=10):只暴露雙側(cè)頸總動(dòng)脈,不阻斷血流;②全腦缺血(brain ischemia,BI)組(n=10):夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈8 min后恢復(fù)再灌注;③LIP+BI組(n=10):夾閉雙側(cè)股動(dòng)脈10 min、再灌注10 min,反復(fù)3次作為L(zhǎng)IP后,即刻夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈8 min作為損傷性缺血,然后恢復(fù)再灌注;④DMTU+LIP+BI組(n=40):于LIP前1h股靜脈內(nèi)注射自由基
8、清除劑DMTU后,即刻給予8 min全腦缺血, DMTU進(jìn)一步分為0 mg/kg、250 mg/kg、500 mg/kg和750 mg/kg4個(gè)亞組;⑤DMTU+sham組(n=10):股靜脈內(nèi)注射DMTU(500 mg/kg),1h后暴露雙側(cè)頸總動(dòng)脈。
實(shí)驗(yàn)方法:①硫堇染色:以上各組(含亞組)大鼠分別取6只在末次手術(shù)后7d斷頭取腦,冠狀切取視交叉后1~4 mm腦片,常規(guī)組織切片,進(jìn)行硫堇染色,觀察遲發(fā)性神經(jīng)元損傷程度。低倍鏡
9、下觀察硫堇染色的海馬組織形態(tài),參照Kitagawa(1990)和Kato(1991)分級(jí)方法,對(duì)海馬CA1區(qū)確定組織學(xué)分級(jí)(histological grade,HG),標(biāo)準(zhǔn)如下:0級(jí):無(wú)神經(jīng)元死亡;Ⅰ級(jí):散在神經(jīng)元死亡;Ⅱ級(jí):成片神經(jīng)元死亡;Ⅲ級(jí):幾乎全部神經(jīng)元死亡。高倍顯微鏡下計(jì)數(shù)雙側(cè)海馬CA1區(qū)每1 mm區(qū)段內(nèi)細(xì)胞膜完整、胞核飽滿、核仁清晰的錐體細(xì)胞數(shù)目,每張切片雙側(cè)海馬各計(jì)數(shù)3個(gè)區(qū)段,取平均數(shù)作為神經(jīng)元密度(neuronal d
10、ensity, ND),作為判定遲發(fā)性神經(jīng)元損傷程度的依據(jù);②SOD、MDA測(cè)定:各組(含亞組)其余4只大鼠在末次手術(shù)后3天于右心室采集血液后,按照試劑盒使用說(shuō)明測(cè)定血清中SOD活力及MDA的含量。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果:①硫堇染色結(jié)果顯示,全腦缺血的sham組、DMTU500+ sham組大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞排列整齊、致密,層數(shù)為2~3層,細(xì)胞形態(tài)完整、邊界清晰,無(wú)細(xì)胞缺失,胞核飽滿、核仁深染、清晰,無(wú)明顯的延遲性神經(jīng)元死亡(del
11、ayed neuronal death,DND),HG為0級(jí),ND值分別為219.11±12.45(cells/mm,下同)、216.00±9.45。BI組大鼠海馬CA1區(qū)出現(xiàn)明顯的DND,錐體細(xì)胞形態(tài)改變明顯,幾乎全部神經(jīng)元死亡或缺失,與全腦缺血的sham組相比,HG(Ⅲ級(jí))明顯升高(P<0.01),ND(48.67±4.34)值明顯降低(P<0.01)。在LIP+BI組、DMTU0+LIP+ BI組海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元未見(jiàn)明顯損傷
12、,僅個(gè)別細(xì)胞胞核固縮,細(xì)胞排列整齊,無(wú)明顯細(xì)胞缺失,HG為0~Ⅰ級(jí),ND值分別為212.44±26.35、209.67±23.78。LIP+BI組與BI組相比,HG明顯降低(P<0.01)、ND值明顯升高(P<0.01)。DMTU250+LIP+BI組、DMTU500+LIP+BI組、DMTU750+LIP+BI組大鼠海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元均有明顯組織學(xué)損傷,細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變,成片死亡或缺失,HG為Ⅰ~Ⅱ級(jí),ND值分別為153.44±2
13、7.20、121.33±18.37和123.78±28.75,與LIP+BI組相比,HG升高(P<0.01),ND值明顯降低(P<0.01)。此外,DMTU500+LIP+BI組與DMTU750+LIP+BI組間無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。上述結(jié)果表明:LIP明顯減輕了大鼠全腦缺血再灌注引起的海馬CA1區(qū)遲發(fā)性神經(jīng)元死亡、發(fā)揮了腦保護(hù)作用;LIP前股靜脈內(nèi)注射自由基清除劑DMTU可部分阻斷LIP的腦保護(hù)作用,且DMTU的最佳劑量為500 mg/k
14、g,提示體液因子自由基部分參與了LIP誘導(dǎo)的腦缺血耐受。②血清SOD活力、MDA含量結(jié)果顯示:BI組大鼠血清SOD活力為161.73±7.86(U/ml,下同),MDA含量為13.41±1.22(nmol/ml,下同)。與BI組相比,LIP+BI組大鼠血清SOD活力(204.02±12.43)明顯增加(P<0.01),MDA含量(7.65±0.85)明顯下降(P<0.01)。與LIP+BI組相比,DMTU500+LIP+BI組大鼠血清S
15、OD活力(182.30±11.33)明顯下降(P<0.01),MDA含量(11.08±1.55)明顯上升(P<0.01)。上述結(jié)果表明,體液因子自由基可部分通過(guò)上調(diào)SOD活力、降低MDA含量參與LIP誘導(dǎo)的大鼠腦缺血耐受。
1.2腺苷A1受體拮抗劑DPCPX對(duì)LIP誘導(dǎo)的大鼠腦缺血耐受的影響
動(dòng)物分組:雄性Wistar大鼠80只,永久凝閉雙側(cè)椎動(dòng)脈后恢復(fù)兩天,隨機(jī)分為以下5組:①全腦缺血的sham組(n=10):只暴
16、露雙側(cè)頸總動(dòng)脈,不阻斷血流;②BI組(n=10):夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈8 min后恢復(fù)再灌注;③LIP+BI組(n=10):夾閉雙側(cè)股動(dòng)脈10 min、再灌注10 min,反復(fù)3次作為L(zhǎng)IP后,即刻夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈8 min作為損傷性缺血,然后恢復(fù)再灌注;④DPCPX+LIP+BI組(n=40):于LIP前5 min股靜脈內(nèi)注射腺苷A1受體拮抗劑DPCPX,即刻給予8 min全腦缺血,DPCPX進(jìn)一步分為0 nmol/kg、16 nmol/
17、kg、32 nmol/kg和48 nmol/kg4個(gè)亞組;⑤DPCPX+sham組(n=10):股靜脈內(nèi)注射腺苷A1受體拮抗劑DPCPX(32nmol/kg),5 min后暴露雙側(cè)頸總動(dòng)脈。
實(shí)驗(yàn)方法同1.1
實(shí)驗(yàn)結(jié)果:①硫(堇)染色結(jié)果顯示,全腦缺血的sham組、DPCPX32+ sham組大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞無(wú)明顯的DND,HG為0級(jí)、ND值分別為221.89±10.08和213.22±12.77。BI組大鼠
18、海馬CA1區(qū)有明顯的組織學(xué)損傷,出現(xiàn)嚴(yán)重的DND,與全腦缺血的sham組相比,HG(Ⅲ級(jí))明顯升高(P<0.01),ND值(46.56±6.45)明顯降低(P<0.01)。LIP+BI組、DPCPX0+LIP+BI組海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)僅個(gè)別細(xì)胞胞核固縮,無(wú)明顯缺失,HG為0~I(xiàn)級(jí),ND值分別為211.56±15.59、213.00±14.67。LIP+BI組與BI組相比,HG明顯降低(P<0.01)、ND值明顯升高(P<0.01)。D
19、PCPX16+LIP+BI組海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元形態(tài)發(fā)生改變,散在死亡或缺失,HG為Ⅰ~Ⅱ級(jí),ND值為124.56±28.05,與LIP+BI組相比,HG升高(P<0.01),ND值明顯降低(P<0.01)。DPCPX32+LIP+ BI組與DPCPX48+LIP+BI組海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元損傷明顯,成片死亡或缺失,HG為Ⅱ~Ⅲ級(jí),ND值分別為77.00±32.25、71.44±28.84,與LIP+BI組相比,HG升高(P<0.0
20、1),ND值明顯降低(P<0.01)。上述結(jié)果表明:LIP明顯減輕了大鼠全腦缺血再灌注引起的海馬CA1區(qū)DND,發(fā)揮了腦保護(hù)作用;LIP前股靜脈內(nèi)注射腺苷A1受體拮抗劑DPCPX可部分阻斷LIP的腦保護(hù)作用,且DPCPX的最佳劑量為32nmol/kg,提示體液因子腺苷參與了LIP誘導(dǎo)的腦缺血耐受。②血清SOD活力、MDA含量結(jié)果顯示:與BI組相比,LIP+BI組大鼠血清SOD活力(204.02±12.43)明顯增加(P<0.01),MD
21、A含量(7.65±0.85)明顯下降(P<0.01)。與LIP+BI組相比,DPCPX32+LIP+BI組大鼠血清SOD活力(175.07±11.18)明顯下降(P<0.01),MDA含量(12.01±1.02)明顯上升(P<0.01)。上述結(jié)果表明,體液因子腺苷可部分通過(guò)上調(diào)SOD活力、降低MDA含量參與LIP誘導(dǎo)的大鼠腦缺血耐受。
1.3腺苷(Ade)對(duì)大鼠腦缺血的影響
動(dòng)物分組:雄性Wistar大鼠70只,永久
22、凝閉雙側(cè)椎動(dòng)脈后恢復(fù)兩天,隨機(jī)分為以下4組:①全腦缺血的sham組(n=10):只暴露雙側(cè)頸總動(dòng)脈,不阻斷血流;②BI組(n=10):夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈8 min后恢復(fù)再灌注;③Ade+BI組(n=40):于BI前10 min股靜脈內(nèi)注射腺苷,其余步驟同BI組,腺苷進(jìn)一步分為0 nmol/kg、10 nmol/kg、20 nmol/kg和40nmol/kg4個(gè)亞組;④Ade+sham組(n=10):股靜脈內(nèi)注射腺苷(20nmol/kg),
23、10 min后暴露雙側(cè)頸總動(dòng)脈。
實(shí)驗(yàn)方法同1.1
實(shí)驗(yàn)結(jié)果:①硫堇染色結(jié)果顯示,全腦缺血的sham組、Ade20+sham組大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞無(wú)明顯的DND。BI組、Ade0+BI組CA1區(qū)組織學(xué)損傷明顯,幾乎全部神經(jīng)元死亡或缺失,HG為Ⅲ級(jí),ND值分別為46.89±7.01、45.89±4.89。BI組與全腦缺血的sham組相比,HG明顯升高(P<0.01),ND值明顯降低(P<0.01)。Ade10+BI
24、組海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元有較明顯組織學(xué)損傷,HG為Ⅰ~Ⅱ級(jí),ND值為145.11±29.04,與BI組相比,HG降低(P<0.01)、ND值升高(P<0.01)。Ade20+BI組、Ade40+BI組CA1區(qū)錐體神經(jīng)元僅有散在死亡,HG分別為0~Ⅱ、0~Ⅰ級(jí),ND值分別為183.44±30.84、193.44±10.80,與BI組相比,HG顯著降低(P<0.01)、ND值顯著升高(P<0.01)。綜上,腺苷能較好地模擬LIP的腦保護(hù)作用
25、,其最佳劑量為20 nmol/kg,進(jìn)一步提示體液因子腺苷參與了腦缺血耐受的誘導(dǎo)。②血清SOD活力、MDA含量結(jié)果表明:BI組大鼠血清SOD活力為161.73±7.86,MDA含量為13.41±1.22。與BI組相比,Ade20+BI組大鼠血清SOD活力(190.14±7.41)明顯增加(P<0.01),MDA含量(8.24±0.84)有明顯下降(P<0.01)。上述結(jié)果進(jìn)一步表明,體液因子腺苷可通過(guò)上調(diào)血清SOD活力、降低MDA含量參
26、與大鼠腦缺血耐受的誘導(dǎo)。
2自由基及腺苷在LIP誘導(dǎo)的大鼠海馬CA1區(qū)p38 MAPK和ERK表達(dá)上調(diào)中的作用
2.1自由基清除劑DMTU對(duì)LIP誘導(dǎo)的大鼠海馬CA1區(qū)p38 MAPK和ERK表達(dá)的影響
動(dòng)物分組同1.1
實(shí)驗(yàn)方法:①免疫組織化學(xué)法:以上各組(含亞組)大鼠分別取5只在末次手術(shù)后12h斷頭取腦,冠狀切取視交叉后1~4 mm腦片,常規(guī)組織切片,用p-p38 MAPK或p-ERK抗體分別
27、標(biāo)記p-p38 MAPK或p-ERK,DAB顯色后,應(yīng)用顯微圖像分析系統(tǒng)測(cè)定陽(yáng)性細(xì)胞顯色面積及積分光密度,相對(duì)定量分析p-p38 MAPK和p-ERK蛋白表達(dá)的變化;②Western blot法:各組(含亞組)其余5只大鼠在末次手術(shù)后12 h取海馬腦組織,按Western blot常規(guī)方法制備待測(cè)樣品,凝膠電泳、抗體孵育后,應(yīng)用凝膠成像分析系統(tǒng)對(duì)電泳條帶進(jìn)行分析處理,相對(duì)定量分析p-p38 MAPK、p-ERK蛋白的表達(dá)。
實(shí)
28、驗(yàn)結(jié)果:①免疫組化結(jié)果顯示:全腦缺血的sham組、BI組和DMTU500+sham組大鼠海馬CA1區(qū)p-p38 MAPK與p-ERK陽(yáng)性表達(dá)較少,陽(yáng)性細(xì)胞胞核著色且較淺,呈棕黃色,p-p38 MAPK的積分光密度分別為12.23±1.52、12.42±1.81和11.95±1.30,p-ERK的積分光密度分別為4.60±0.19、4.75±0.23和4.65±0.20,p-p38 MAPK的陽(yáng)性細(xì)胞總面積分別為5366.53±926.5
29、9(μm2,下同)、5783.77±874.26和5582.38±887.95,p-ERK的陽(yáng)性細(xì)胞總面積分別為3395.34±291.14、3453.57±374.73和3610.90±210.03。LIP+BI組、DMTU0+LIP+BI組CA1區(qū)p-p38 MAPK和p-ERK的陽(yáng)性表達(dá)明顯增多,胞核深染,呈深棕黃色,p-p38 MAPK的積分光密度分別為68.57±6.87和66.37±5.03,p-ERK的積分光密度分別為31
30、.49±3.66和30.62±2.90,p-p38 MAPK的陽(yáng)性細(xì)胞總面積分別為19975.52±1718.97和18513.65±1591.89,p-ERK的陽(yáng)性細(xì)胞總面積分別為15310.05±618.57和14944.25±545.41,LIP+BI組與BI組相比均有顯著性差異(P<0.01)。DMTU250+LIP+BI組、DMTU500+LIP+BI組和 DMTU750+LIP+BI組海馬CA1區(qū)p-p38 MAPK與p-E
31、RK陽(yáng)性表達(dá)均有明顯的下降,胞核著色且較淺,p-p38 MAPK的積分光密度分別為48.19±4.50、36.32±3.03和35.29±3.18,p-ERK的積分光密度分別為22.60±2.23、13.27±2.01和13.48±2.18,p-p38 MAPK的陽(yáng)性細(xì)胞總面積分別為12924.70±1231.43、9604.63±1077.03和9388.41±989.71,p-ERK的陽(yáng)性細(xì)胞總面積分別為9562.06±355.64
32、、6550.33±343.35和6687.39±235.33,與LIP+BI組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01);②Western blot結(jié)果顯示,全腦缺血的sham組、BI組和DMTU500+sham組大鼠海馬CA1區(qū)p-p38MAPK和p-ERK的表達(dá)量較低,p-p38 MAPK的IOD值與對(duì)應(yīng)β-actin的IOD值的比值分別為0.24±0.04、0.27±0.04和0.27±0.03,p-ERK的IOD值與對(duì)應(yīng)β-actin的
33、IOD值的比值分別為0.35±0.06、0.43±0.08和0.36±0.04。LIP+BI組和DMTU0+LIP+BI組海馬CA1區(qū)p-p38 MAPK和p-ERK的表達(dá)量明顯升高,p-p38 MAPK的IOD值與對(duì)應(yīng)β-actin的IOD值的比值分別為0.67±0.08和0.68±0.08,p-ERK的IOD值與對(duì)應(yīng)β-actin的IOD值的比值分別為0.83±0.07和0.84±0.07,LIP+BI組與BI組相比有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異
34、(P<0.01)。DMTU250+LIP+BI組、DMTU500+LIP+BI組和DMTU750+LIP+BI組海馬CA1區(qū)p-p38MAPK和p-ERK的表達(dá)量均明顯下降,與LIP+BI組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。上述免疫組化、Western blot結(jié)果表明,LIP部分通過(guò)自由基上調(diào)了腦缺血大鼠海馬CA1區(qū)p-p38 MAPK和p-ERK的表達(dá)。
2.2腺苷A1受體拮抗劑DPCPX對(duì)LIP誘導(dǎo)的大鼠海馬CA1區(qū)p3
35、8 MAPK和ERK表達(dá)的影響
動(dòng)物分組同1.2
實(shí)驗(yàn)方法同2.1
實(shí)驗(yàn)結(jié)果:①免疫組化結(jié)果顯示:全腦缺血的sham組、BI組和DPCPX32+sham組大鼠海馬CA1區(qū)p-p38MAPK與p-ERK陽(yáng)性表達(dá)較少,陽(yáng)性細(xì)胞胞核著色且較淺,呈棕黃色,p-p38MAPK的積分光密度分別為12.23±1.52、12.42±1.81和12.96±1.09,p-ERK的積分光密度分別為4.60±0.19、4.75±0
36、.23和4.63±0.19,p-p38 MAPK的陽(yáng)性細(xì)胞總面積分別為5366.53±926.59、5783.77±874.26和5850.75±722.59,p-ERK的陽(yáng)性細(xì)胞總面積分別為3395.34±291.14、3453.57±374.73和3322.09±291.01。LIP+BI組、DPCPX0+LIP+BI組大鼠海馬CA1區(qū)p-p38 MAPK與p-ERK陽(yáng)性表達(dá)明顯增多,胞核深染,呈深棕黃色,p-p38 MAPK的積分
37、光密度分別為68.57±6.87和65.67±5.69,p-ERK的積分光密度分別為31.49±3.66和30.88±2.43,p-p38 MAPK的陽(yáng)性細(xì)胞總面積分別為19975.52±1718.97和18239.42±1594.06,p-ERK的陽(yáng)性細(xì)胞總面積分別為15310.05±618.57和16071.61±689.89,LIP+BI組與BI組相比有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。DPCPX16+LIP+BI組、DPCPX32
38、+LIP+BI組、DPCPX48+LIP+BI組海馬CA1區(qū)p-p38 MAPK與p-ERK陽(yáng)性表達(dá)均有明顯的下降,胞核著色且較淺,p-p38 MAPK的積分光密度分別為38.74±4.02、28.05±2.71和27.40±2.20,p-ERK的積分光密度分別為23.49±1.84、16.24±1.32和16.88±1.43,p-p38 MAPK的陽(yáng)性細(xì)胞總面積分別為12340.18±1056.76、8963.94±935.41和93
39、96.58±850.62,p-ERK的陽(yáng)性細(xì)胞總面積分別為9417.67±345.75、7826.61±233.91和8013.11±252.23,與LIP+BI組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01);②Western blot結(jié)果中各組p-p38 MAPK與p-ERK表達(dá)趨勢(shì)與免疫組化結(jié)果一致。上述結(jié)果表明,LIP部分通過(guò)腺苷上調(diào)腦缺血大鼠海馬CA1區(qū)p-p38 MAPK和p-ERK的表達(dá)。
2.3腺苷對(duì)腦缺血大鼠海馬CA1區(qū)
40、p38 MAPK和ERK表達(dá)的影響
動(dòng)物分組同1.3
實(shí)驗(yàn)方法同2.1
實(shí)驗(yàn)結(jié)果:①免疫組化結(jié)果顯示:全腦缺血的sham組、BI組、Ade0+BI組和Ade20+sham組大鼠海馬CA1區(qū)p-p38 MAPK與p-ERK陽(yáng)性表達(dá)較少,陽(yáng)性細(xì)胞胞核著色且較淺,呈棕黃色,p-p38 MAPK的積分光密度分別為12.23±1.52、12.42±1.81、13.02±1.18和14.54±1.34,p-ERK的積分
41、光密度分別為4.60±0.19、4.75±0.23、4.66±0.20和4.59±0.31,p-p38MAPK的陽(yáng)性細(xì)胞總面積分別為5366.53±926.59、5783.77±874.26、5529.65±766.16和5272.40±742.64,p-ERK的陽(yáng)性細(xì)胞總面積分別為3395.34±291.14、3453.57±374.73、3635.09±255.83和3486.83±310.10。Ade10+BI組、Ade20+BI
42、組和Ade40+BI組海馬CA1區(qū)p-p38MAPK與p-ERK陽(yáng)性表達(dá)均有明顯增多,胞核深染,呈深棕黃色,p-p38MAPK積分光密度分別為23.09±1.46、41.61±3.22和39.57±5.02,p-ERK的積分光密度分別為12.61±1.67、25.60±2.06和24.54±1.59,p-p38 MAPK陽(yáng)性細(xì)胞總面積分別為9078.42±909.58、14711.33±1226.75和14549.98±1129.92,
43、p-ERK的陽(yáng)性細(xì)胞總面積分別為8551.07±368.26、13350.40±651.58和12869.38±734.89,與BI組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01);②Western blot結(jié)果顯示,全腦缺血的sham組、BI組、Ade0+BI組和Ade20+sham組大鼠海馬CA1區(qū)p-p38和p-ERK的表達(dá)量較低。Ade10+BI組、Ade20+BI組和Ade40+BI組CA1區(qū)p-p38和p-ERK的表達(dá)量有較明顯升高,與
44、BI組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。上述結(jié)果表明,腺苷可模擬LIP的作用,上調(diào)海馬CA1區(qū)p38 MAPK和ERK的表達(dá)。
結(jié)論:
(1) LIP前經(jīng)股靜脈給予自由基清除劑或腺苷A1受體拮抗劑可部分逆轉(zhuǎn)LIP的腦保護(hù)作用,經(jīng)股靜脈給予腺苷可部分模擬LIP的腦保護(hù)作用,提示體液因子自由基及腺苷參與了LIP的腦保護(hù)作用。
(2) LIP前經(jīng)股靜脈給予自由基清除劑或腺苷A1受體拮抗劑可部分阻斷LIP對(duì)腦缺血
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