腦紅蛋白在肢體缺血預處理腦保護中的作用及其機制.pdf

1、缺血性腦病具有發(fā)病率、致殘率和死亡率高的特點，嚴重危害人類的健康。且近年來其發(fā)病率呈不斷上升的趨勢，隨著我國老齡化社會的到來，形勢將更加嚴峻。調動機體內源性保護機制提高神經細胞對缺血性損害的抵抗力作為缺血性腦病防治的新策略，受到醫(yī)學界的高度重視。本實驗應用大鼠四血管閉塞全腦缺血整體動物模型，觀察Ugb在LIP誘導的腦缺血耐受中表達的變化、以及上調或阻斷Ngb表達對LIP腦保護作用的影響，探討Ngb在LIP抗腦缺血/再灌注損傷中的作用；在

2、此基礎上，從線粒體的結構和功能以及線粒體介導的凋亡途徑等方面探討Ngb在LIP誘導的腦缺血耐受中的線粒體機制；并進一步觀察青年和老年大鼠腦缺血后海馬CA1區(qū)Ngb表達的變化及LIP對其影響，以及LIP對正常大鼠海馬CA1區(qū)Ngb表達的影響，為全面深入地評價腦缺血后海馬Ngb表達的變化及LIP的保護作用提供實驗依據，為臨床上腦血管疾病的防治研究提供新線索和思路。
　　 1.Ngb參與LIP誘導的大鼠腦缺血耐受
　　 目的：

3、觀察ngb在LIP誘導的腦缺血耐受中表達的變化、以及應用Ngb誘導劑Hemin和Ngb AS-ODNs分別上調和抑制Ngb表達對LIP腦保護作用的影響，確定Ngb在LIP誘導的大鼠腦缺血耐受中的作用。
　　 1.1 LIP上調腦缺血大鼠海馬CA1區(qū)Ngb表達
　　 結果：RT-PCR.和Western blot分析顯示，腦缺血sham組海馬CA1區(qū)Ngb mRNA和蛋白有一定的表達。與腦缺血sham組相比，LIP組Nab

4、mRNA和蛋白表達明顯增加。腦缺血組海馬CA1區(qū)Ngb mRNA和蛋白表達較腦缺血sham組明顯下降。與腦缺血sham組和腦缺血組相比，LIP+腦缺血組Ngb mRNA和蛋白表達明顯增加，而LIP sham+腦缺血組Nab表達則無明顯變化。
　　 結果表明，LIP可誘導腦缺血耐受，同時上調腦內Ngb的表達。
　　 1.2 Hemin上調Ngb表達誘導腦缺血耐受
　　 結果：RT-PCR和Western blot分

5、析顯示，與腦缺血sham組相比，腦缺血組和Hemin溶劑+腦缺血組海馬CA1區(qū)Ngb mRNA和蛋白表達顯著下降。與腦缺血組和Hemin溶劑+腦缺血組相比，Hemin+腦缺血組Ngb mRNA和蛋白表達顯著增加，尤以20 mg/kg和40 mg/kg組明顯，并呈現(xiàn)劑量依賴性。
　　 結果表明，Hemin可上調Ngb表達而誘導腦缺血耐受。
　　 1.3 Blgb AS-ODNs抑制LIP抗腦缺血引起的海馬CA1區(qū)DND的作

6、用
　　 結果：Western blot分析顯示，與ACSF+LIP+腦缺血組相比，AS-ODNs+LIP+腦缺血組海馬CA1區(qū)Ngb蛋白表達顯著降低，并與AS-ODNs的劑量呈現(xiàn)依賴性，而LIP前側腦室注射S-ODNs，對CA1區(qū)Ngb蛋白表達無明顯影響。
　　 結果表明，NgbAS-ODNs可阻斷Ngb表達，進而阻斷LIP的腦保護作用。
　　 1.4 LIP和Hemin降低腦缺血引起的血清Ngb蛋白含量增加<

7、br>　　 結果：ELISA顯示，腦缺血sham組和LIP組血清Ngb蛋白含量較低，二者之間無統(tǒng)計學差異。與腦缺血sham組相比，腦缺血組血清Ngb蛋白含量顯著增加。而腦缺血前給予LIP預處理，血清Ngb蛋白含量明顯下降。與腦缺血組相比，Hemin（20 mg/Kg）+腦缺血組血清Ngb蛋白含量明顯下降；而Hemin溶劑+腦缺血組血清Ngb蛋白含量無明顯變化。
　　 以上結果表明，LIP和Hemin可明顯降低腦缺血后血清Ngb

8、蛋白含量升高。
　　 2.Ngb通過線粒體機制參與LIP誘導的腦缺血耐受
　　 目的：通過觀察Ngb表達增加對海馬CA1區(qū)神經細胞線粒體膜電位、線粒體Na+-K+-ATP酶活性、神經元及線粒體超微結構、Bcl-2和Bax mRNA表達的影響，探討Ngb是否通過線粒體機制參與LIP誘導的腦缺血耐受。
　　 結果：流式細胞儀檢測神經細胞線粒體膜電位顯示，腦缺血sham組海馬CA1區(qū)神經細胞線粒體膜電位較高。與腦缺血s

9、ham組相比，腦缺血后線粒體膜電位顯著降低。與腦缺血組相比，LIP+腦缺血組線粒體膜電位明顯增加。與LIP+腦缺血組相比，AS-ODNs+LIP+腦缺血組線粒體膜電位顯著降低，而S-ODNs+LIP+腦缺血組則無明顯變化。與腦缺血組相比，Hemin+腦缺血組線粒體膜電位明顯增高，而Hemin溶劑+腦缺血組則無明顯變化。
　　 海馬CA1區(qū)線粒體Na+-K+-ATP酶活性測定顯示，在6 h時間點，腦缺血sham組該酶活性較高，而腦

10、缺血后則較腦缺血sham組明顯下降。與腦缺血組相比，LIP+腦缺血組該酶活性明顯下降。與LIP+腦缺血組相比，AS-ODNs+LIP+腦缺血組該酶活性顯著增加，而LIP前側腦室注射Ngb S-ODNs，對該酶活性無影響。與腦缺血組相比，Hemin+腦缺血組該酶活性明顯降低，而Hemin溶劑+腦缺血組則無明顯變化。在24 h時間點，腦缺血sham組線粒體Na+-K+-ATP酶活性較高。與腦缺血sham組相比，腦缺血后該酶活性顯著下降。與腦

11、缺血組相比，LIP+腦缺血組該酶活性明顯增加。與LIP+腦缺血組相比，AS-ODNs+LIP+腦缺血組該酶活性顯著降低，而S-ODNs+LIP+腦缺血組則無明顯變化。與腦缺血組相比，Hemin+腦缺血組該酶活性明顯增加，而Hemin溶劑+腦缺血組則無明顯變化。
　　 結果表明，Ngb表達增加可通過調控海馬CA1區(qū)神經細胞線粒體膜電位、Na+-K+-ATP酶活性、線粒體超微結構、Bcl-2和Bax mRNA表達等線粒體機制參與LI

12、P誘導的腦缺血耐受。
　　 3.青年和老年大鼠腦缺血后海馬CA1區(qū)Ngb表達的變化及LIP對其影響
　　 目的：觀察比較青年和老年大鼠腦缺血時海馬CA1區(qū)Ngb表達的變化及LIP對其影響，為進一步評價腦缺血后海馬Ngb表達的變化及LIP的保護作用提供實驗依據。
　　 結果：RT-PCR分析顯示，Ngb和GAPDH擴增后的產物片段與設計相符。老年腦缺血組Ngb mRNA表達比青年腦缺血組明顯降低。LIP可明顯上調青

13、年和老年大鼠腦缺血后Ngb的mRNA表達，但老年大鼠（LIP+老年腦缺血組）的上調幅度小于青年大鼠（LIP+青年腦缺血組）。
　　 Western blot結果顯示，各組均可在分子量相當于17KD和42KD的區(qū)域見Ngb和β-actin蛋白表達條帶。Ngb蛋白表達在老年大鼠腦缺血組比青年大鼠腦缺血組顯著降低，LIP后青年和老年腦缺血大鼠Ngb的蛋白表達均明顯上調，但老年大鼠（LIP+老年腦缺血組）的上調幅度小于青年大鼠（LIP+

14、青年腦缺血組）。
　　 結果表明，老年大鼠全腦缺血后Ngb的表達及LIP對其上調作用較青年大鼠明顯減弱，這可能是老年大鼠腦缺血后損傷較重和LIP對老年大鼠腦缺血保護作用較弱的原因之一。
　　 4.LIP上調正常大鼠海馬CA1區(qū)Ngb表達
　　 目的：觀察LIP后不同時間點正常大鼠海馬CA1區(qū)Ngb表達的變化，為研究和評價LIP對正常機體的腦保護作用提供實驗依據。
　　 結果：RT-PCR分析顯示，在150

15、bp和349bp處分別為Ngb和內參GAPDH的擴增條帶。Sham組海馬CA1區(qū)有一定的Ngb mRNA表達。與sham組相比，LIP后海馬CA1區(qū)Ngb mRNA.表達增加。這種增加于LIP后30 min最明顯，隨后逐漸下降，在6 h時接近sham組水平。
　　 Western blot結果顯示，各組均可在分子量相當于17KD和42KD的區(qū)域分別出現(xiàn)Ngb和β-actin蛋白表達條帶。Sham組海馬CA1區(qū)有一定的Ngb蛋白表

16、達。與sham組相比，LIP后海馬CA1區(qū)Ngb蛋白表達增加。這種增加于LIP后1 h達到高峰，隨后逐漸下降，至1 d時接近sham組。
　　 以上結果表明，LIP能上調正常大鼠海馬CA1區(qū)Ngb mRNA和蛋白表達，Ngb mRNA表達高峰早于蛋白表達高峰。
　　 5.結論
　　 （1）LIP能明顯上調腦缺血大鼠海馬CA1區(qū)Ngb mRNA和蛋白表達，同時LIP可明顯抑制腦缺血后CA1區(qū)錐體神經元DND，降低血

17、清Ngb蛋白含量；腹腔注射Ngb誘導劑Hemin能模擬LIP誘導的腦缺血耐受，而側腦室注射Ngb AS-ODNs可部分阻斷LIP的腦保護作用。這些結果表明，Ngb表達上調在LIP誘導腦缺血耐受中發(fā)揮重要作用。
　　 （2）Ngb表達增加通過增加線粒體膜電位、改善線粒體Na+-K+-ATP酶活性、保護線粒體超微結構、調節(jié)Bcl-2和Bax mRNA表達等線粒體機制參與LIP誘導的腦缺血耐受。
　　 （3）老年大鼠全腦缺血后