蛋白激酶C在電針預(yù)處理和遠(yuǎn)程缺血后處理誘導(dǎo)腦保護(hù)中的作用.pdf

1、防治腦缺血/再灌注損傷，尋找有效的治療藥物及措施，促進(jìn)腦卒中后中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能恢復(fù)，一直是生命科學(xué)研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，缺血前給予一定的預(yù)處理措施，能有效減輕缺血后的損傷，即缺血耐受(Ischemictolerance)。近年來(lái)，已發(fā)現(xiàn)眾多不同的刺激均能誘導(dǎo)產(chǎn)生腦缺血耐受。
　　我們的以前研究已經(jīng)證實(shí)電針預(yù)處理可以誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生腦缺血耐受。新近的研究發(fā)現(xiàn)電針預(yù)處理可以增加大鼠腦內(nèi)源性大麻素2-AG和AEA的含量，并上調(diào)大麻素C

2、B1受體，且CB1受體拮抗劑能夠逆轉(zhuǎn)電針預(yù)處理誘導(dǎo)腦缺血耐受，表明電針預(yù)處理通過(guò)大麻素CB1受體介導(dǎo)腦保護(hù)作用。然而CB1受體通過(guò)何種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路介導(dǎo)電針預(yù)處理誘導(dǎo)腦缺血耐受效應(yīng)呢？
　　另外，由于預(yù)處理需在缺血前實(shí)施，而臨床上許多缺血/再灌注損傷的發(fā)生不可預(yù)見(jiàn)，使其臨床應(yīng)用價(jià)值受限。2003年Zhao等提出了“缺血后處理(IschemicPostconditioning)”的概念，即在缺血再灌注早期，進(jìn)行一次或數(shù)次短暫重復(fù)的心

3、肌缺血再灌注，能提高心肌對(duì)之前發(fā)生的較長(zhǎng)時(shí)間缺血的耐受性。由于缺血后處理比預(yù)處理在實(shí)施上有更好的可預(yù)測(cè)性及臨床可控性，在缺血再灌注損傷方面開(kāi)啟了一個(gè)新的治療窗口。在此基礎(chǔ)上，Andreka等在2007年證實(shí)，心臟缺血后給予短暫的肢體缺血，也可以對(duì)心臟缺血再灌注損傷起到保護(hù)作用，提出“遠(yuǎn)程后處理(RemotePostconditioning)”的概念。與缺血后處理相比，肢體遠(yuǎn)程缺血后處理更安全，也更易于實(shí)施，更符合臨床應(yīng)用的實(shí)際需求。然而

4、，目前關(guān)于遠(yuǎn)程缺血后處理是否對(duì)腦有保護(hù)作用，有待進(jìn)一步證實(shí)，而且其保護(hù)機(jī)制也需進(jìn)一步闡述。
　　蛋白激酶C(PKC)家族擁有10種同工酶，中樞神經(jīng)細(xì)胞和組織中可以檢測(cè)到PKCα、PKCβ1、PKCβ2、PKCγ、PKCε、PKCδ、PKCη、PKCθ和PKCξmRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)。大量的研究已報(bào)道不同PKC同工酶參與腦缺血損傷和預(yù)處理的腦保護(hù)機(jī)制并發(fā)揮重要的作用，其中PKCε和PKCδ的作用比較明確，目前大多數(shù)證據(jù)支持缺血前PKC

5、ε激活可模擬預(yù)處理保護(hù)缺血再灌注損傷，而再灌注期間PKCδ激活參與再灌注損傷。因此，本研究擬采用SD大鼠局灶性腦缺血/再灌注（MCAO）模型，研究遠(yuǎn)程缺血后處理的腦保護(hù)作用，并探討PKCε和PKCδ在電針預(yù)處理和遠(yuǎn)程缺血后處理誘導(dǎo)腦保護(hù)中的角色。
　　第一部分：電針預(yù)處理通過(guò)CB1受體激活εPKC誘導(dǎo)大鼠腦缺血耐受
　　實(shí)驗(yàn)一、電針預(yù)處理對(duì)大鼠腦εPKC活化的影響
　　目的：探討電針預(yù)處理對(duì)大鼠腦內(nèi)εPKC活化的影響。

6、方法：成年雄性SD大鼠隨機(jī)分為3組，每組各5只動(dòng)物。Naive組：動(dòng)物不進(jìn)行任何處理。Sham組：動(dòng)物接受與EA組動(dòng)物相同的麻醉（1％戊巴比妥鈉，40mg/kg，i.p.）和針刺，但不通電刺激。EA組：動(dòng)物在麻醉下接受30min的電針刺激。動(dòng)物電針預(yù)處理后30min、60min和120min時(shí)斷頭取腦行Westernblot分析εPKC活化。結(jié)果：電針預(yù)處理后30min、60min和120min時(shí)，EA組εPKC比率明顯高于Sham組（

7、升高44％，P<0.05），εPKC轉(zhuǎn)位的高峰出現(xiàn)在電針預(yù)處理后60min時(shí)（升高75％，P<0.01）。Sham組和Naive組間動(dòng)物εPKC激活程度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論：電針預(yù)處理后30min即可觀察到腦內(nèi)εPKC活化增加，可持續(xù)到電針預(yù)處理后120min，其中預(yù)處理后60min時(shí)εPKC活化達(dá)到頂峰。
　　實(shí)驗(yàn)二、εPKC活化對(duì)腦缺血再灌注損傷的影響
　　目的：探討特異性εPKC激動(dòng)劑TAT-ψεRA

8、CK對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的影響。方法：成年雄性SD大鼠隨機(jī)分為3組，每組各10只動(dòng)物。MCAO組：動(dòng)物行120min大腦中動(dòng)脈阻閉（MCAO）后再灌注72h。TAT-ψεRACK+MCAO組：動(dòng)物MCAO前2h給予TAT-ψεRACK0.2mg/kg（溶于1ml生理鹽水，i.p.），余同MCAO組。TAT-β-Gal+MCAO組：動(dòng)物MCAO前2h給予TAT-β-Gal0.2mg/kg（溶于1ml生理鹽水，i.p.），余同MCAO組。

9、所有動(dòng)物于再灌注后72h行神經(jīng)功能評(píng)分和腦梗死容積測(cè)定。結(jié)果：再灌注后72h，與MCAO組相比，TAT-ψεRACK+MCAO組動(dòng)物神經(jīng)功能評(píng)分顯著增高，腦梗死容積百分比明顯減?。≒<0.01）。MCAO組和TAT-β-Gal+MCAO組間動(dòng)物神經(jīng)功能評(píng)分和腦梗死容積百分比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論：給予εPKC特異性激動(dòng)劑能夠模擬電針預(yù)處理的腦保護(hù)作用。
　　實(shí)驗(yàn)三、TAT-εV1-2對(duì)電針預(yù)處理誘導(dǎo)的腦保護(hù)作用的影

10、響
　　目的：探討特異性εPKC抑制劑TAT-εV1-2對(duì)電針預(yù)處理誘導(dǎo)的腦保護(hù)作用的影響。方法：成年雄性SD大鼠隨機(jī)分為5組，每組各10只。所有動(dòng)物MCAO前3h給予1％戊巴比妥鈉（40mg/kg，i.p.）麻醉。MCAO組：動(dòng)物行120min大腦中動(dòng)脈阻閉（MCAO）后再灌注72h。EA+MCAO組：動(dòng)物MCAO前2h接受30min電針預(yù)處理，余同MCAO組。TAT-εV1-2+EA組：動(dòng)物電針預(yù)處理前30min給予TAT-ε

11、V1-20.2mg/kg（溶于1ml生理鹽水，i.p.），余同EA+MCAO組。TAT-β-Gal+EA組：動(dòng)物電針預(yù)處理前30min給予TAT-β-Gal0.2mg/kg（溶于1ml生理鹽水，i.p.），余同EA+MCAO組。TAT-εV1-2+MCAO組：動(dòng)物MCAO前3h給予TAT-εV1-20.2mg/kg（溶于1ml生理鹽水，i.p.），余同MCAO組。所有動(dòng)物于再灌注后72h行神經(jīng)功能評(píng)分和腦梗死容積測(cè)定。結(jié)果：再灌注后72

12、h，與MCAO組相比，EA+MCAO組和TAT-β-Gal+EA組動(dòng)物神經(jīng)功能評(píng)分明顯增高，腦梗死容積百分比明顯減?。≒<0.01），EA+MCAO組和TAT-β-Gal+EA組兩組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。TAT-εV1-2+EA組動(dòng)物神經(jīng)功能評(píng)分高于MCAO組（P<0.05）但小于EA+MCAO組（P<0.01）；TAT-εV1-2+EA組動(dòng)物腦梗死容積百分比小于MCAO組（P<0.05）但大于EA+MCAO組（P<0

13、.01）。TAT-εV1-2+MCAO組和MCAO組間動(dòng)物神經(jīng)功能評(píng)分和腦梗死容積百分比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論：電針預(yù)處理前給予εPKC特異性抑制劑可部分逆轉(zhuǎn)電針預(yù)處理對(duì)局灶性腦缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用。
　　實(shí)驗(yàn)四、εPKC活化對(duì)腦缺血再灌注后神經(jīng)元凋亡的影響
　　目的：探討εPKC活化對(duì)腦缺血再灌注后神經(jīng)元凋亡的影響。方法：成年雄性SD大鼠隨機(jī)分為5組，每組各5只動(dòng)物。所有動(dòng)物MCAO前3h給予1％戊巴

14、比妥鈉（40mg/kg，i.p.）麻醉。Control組：接受除缺血外與MCAO組相同的處理，為MCAO組的對(duì)照。MCAO組：動(dòng)物行120min大腦中動(dòng)脈阻閉（MCAO）后再灌注24h。EA+MCAO組：動(dòng)物MCAO前2h接受30min電針預(yù)處理，余同MCAO組。TAT-εV1-2+EA組：動(dòng)物電針預(yù)處理前30min給予TAT-εV1-20.2mg/kg（溶于1ml生理鹽水，i.p.），余同EA+MCAO組。TAT-ψεRACK+MCA

15、O組：動(dòng)物MCAO前3h給予TAT-ψεRACK0.2mg/kg（溶于1ml生理鹽水，i.p.），余同MCAO組。所有動(dòng)物于再灌注后24h行TUNEL染色和Westernblot分析Bcl-2和Bax表達(dá)。結(jié)果：再灌注后24h，Control組動(dòng)物腦片中TUNEL染色為陰性，MCAO組和TAT-εV1-2+EA組動(dòng)物腦缺血半影區(qū)顯示大量TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞，而EA+MCAO組和TAT-ψεRACK+MCAO組動(dòng)物腦缺血半影區(qū)僅顯示少量TU

16、NEL陽(yáng)性細(xì)胞。與MCAO組相比，EA+MCAO組和TAT-ψεRACK+MCAO組動(dòng)物腦缺血半影區(qū)TUNEL陽(yáng)性神經(jīng)元計(jì)數(shù)明顯減少（P<0.01）。與EA+MCAO組相比，TAT-εV1-2+EA組動(dòng)物腦缺血半影區(qū)TUNEL陽(yáng)性神經(jīng)元計(jì)數(shù)明顯增多（P<0.01）。TAT-εV1-2+EA組和MCAO組間動(dòng)物神經(jīng)功能評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。缺血/再灌注損傷可使腦缺血半影區(qū)Bcl-2和Bax含量顯著增高(P<0.01，MCA

17、OvsControl)。與MCAO組相比，EA和TAT-ψεRACK預(yù)處理能夠進(jìn)一步增高Bcl-2含量，降低Bcl-2含量(P<0.01，MCAO)。然而在預(yù)處理前給予TAT-εV1-2可抑制電針預(yù)處理所致的Bcl-2含量增高和Bax含量降低(P<0.05,TAT-εV1-2+EAvsEA+MCAO)。結(jié)論：εPKC活化可上調(diào)腦缺血半影區(qū)Bcl-2表達(dá)、抑制Bax表達(dá)，減少神經(jīng)元凋亡。
　　實(shí)驗(yàn)五、大麻素受體拮抗劑對(duì)電針預(yù)處理腦保

18、護(hù)作用的影響
　　目的：探討大麻素CB1受體拮抗劑AM251和CB1受體拮抗劑AM630對(duì)電針預(yù)處理腦保護(hù)作用的影響。方法：成年雄性SD大鼠隨機(jī)分為7組，每組各10只動(dòng)物。MCAO組：動(dòng)物行120min大腦中動(dòng)脈阻閉（MCAO）后再灌注72h。EA+MCAO組：動(dòng)物MCAO前2h接受30min電針預(yù)處理，余同MCAO組。AM251+EA組：動(dòng)物在電針預(yù)處理前30min給予CBR1拮抗劑AM2511mg/kg（i.p.），余同EA+

19、MCAO組。AM251+MCAO組：動(dòng)物在MCAO前3h給予CBR1拮抗劑AM2511mg/kg（i.p.），余同MCAO組。AM630+EA組：動(dòng)物在電針預(yù)處理前30min給予CBR2拮抗劑AM6301mg/kg（i.p.），余同EA+MCAO組。AM630+MCAO組：動(dòng)物在MCAO前3h給予CBR2拮抗劑AM6301mg/kg（i.p.），余同MCAO組。Vehicle+EA組：動(dòng)物在電針預(yù)處理前30min給予溶劑3ml/kg（i

20、.p.），余同EA+MCAO組。所有動(dòng)物于再灌注后72h行神經(jīng)功能評(píng)分和腦梗死容積測(cè)定。結(jié)果：再灌注后72h，與MCAO組相比，EA+MCAO組動(dòng)物神經(jīng)功能評(píng)分明顯增高，腦梗死容積百分比明顯減?。≒<0.05）。電針預(yù)處理前給予AM251逆轉(zhuǎn)了電針預(yù)處理的腦保護(hù)作用（P<0.05，AM251+EAvsEA+MCAO）。而電針預(yù)處理前給予AM630和溶劑（Vehicle）均不影響電針預(yù)處理的保護(hù)效果（P>0.05，AM630+EAvsEA

21、+MCAO，Vehicle+EAvsEA+MCAO）。AM251和AM630本身對(duì)MCAO所致的神經(jīng)功能損傷沒(méi)有影響(P>0.05，AM251+MCAOvsMCAO，AM630+MCAOvsMCAO)。結(jié)論：給予CBR1拮抗劑能夠逆轉(zhuǎn)電針預(yù)處理的神經(jīng)保護(hù)作用，而CBR2拮抗劑對(duì)電針預(yù)處理的腦保護(hù)作用沒(méi)有影響。
　　實(shí)驗(yàn)六、大麻素受體拮抗劑對(duì)電針預(yù)處理后εPKC活化的影響
　　目的：探討大麻素CB1受體拮抗劑AM251和CB1