Notch信號通路在重復(fù)HBO預(yù)處理腦保護(hù)效應(yīng)中的作用研究.pdf

1、缺血性腦卒中是臨床上常見的腦血管意外,已被世界衛(wèi)生組織(WHO)認(rèn)定為危害人類健康的“頭號殺手”。目前仍無有效的防治措施!近年來大量的研究發(fā)現(xiàn),各種不同的非缺血預(yù)處理方式均誘導(dǎo)出相同的缺血耐受效應(yīng),由此我們推測,這些不同的預(yù)處理方式極有可能作用于一些共同的信號通路從而誘導(dǎo)保護(hù)作用。目前已證實(shí)對胚胎發(fā)育具有重要作用的Notch信號通路在腦缺血損傷和修復(fù)中也扮演了一定的角色。高壓氧(hyperbaric oxygen, HBO)由于其安全可

2、靠及可操作性強(qiáng)的優(yōu)勢,作為非缺血預(yù)處理的一個(gè)重要研究方向,其神經(jīng)保護(hù)作用已得到臨床證實(shí)。故本研究主要采用高壓氧預(yù)處理的方式研究其對Notch信號通路的影響以及Notch信號通路在其腦保護(hù)中所起的作用。
　　第一部分重復(fù)HBO預(yù)處理對Notch信號通路的影響研究
　　方法：1、重復(fù)驗(yàn)證高壓氧預(yù)處理的腦保護(hù)效應(yīng)30只雄性SD大鼠隨機(jī)分為三組:假手術(shù)組(sham),缺血再灌注組(I/R),高壓氧預(yù)處理組(HBO+I/R)。高壓氧預(yù)

3、處理?xiàng)l件參照Xiong L等方法。末次預(yù)處理后24h,行MCAO缺血2h,于再灌注24,48,72h進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評分,于72h斷頭取腦測定腦梗死面積。
　　2、重復(fù)HBO預(yù)處理對Notch信號通路的影響研究
　　2.1、腦缺血再灌注后Notch信號通路的表達(dá)變化48只雄性SD大鼠隨機(jī)分為兩組:假手術(shù)組(sham,n=12),缺血再灌注組(I/R,n=36)。I/R組行MCAO缺血2h,再灌注后2,24,72h取缺血側(cè)皮層及

4、紋狀體。利用免疫熒光,Western blotting技術(shù)檢測各時(shí)相點(diǎn)Notch信號通路活性分子NICD的表達(dá)情況,同時(shí)利用RT-PCR技術(shù)測定其下游基因HES-1的表達(dá)情況。
　　2.2、高壓氧預(yù)處理后Notch信號通路的表達(dá)變化雄性SD大鼠96只(280~320g)隨機(jī)分為四組:假手術(shù)組(sham,n=12),缺血再灌注組(I/R,n=36),單純高壓氧組(HBO only,n=12),高壓氧+缺血再灌注組(HBO+I/R,n

5、=36)。末次高壓氧預(yù)處理后24h,HBO only組取材;I/R組、HBO+I/R組一起建立MCAO模型缺血2h,再灌注后2,24,72h取缺血側(cè)皮層及紋狀體。利用免疫熒光,Western blotting技術(shù)檢測各時(shí)相點(diǎn)Notch信號通路活性分子NICD的表達(dá)情況,同時(shí)利用RT-PCR技術(shù)測定其下游基因HES-1的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：1、高壓氧預(yù)處理具有腦保護(hù)效應(yīng)再灌注后24,48,72h神經(jīng)功能學(xué)評分,HBO+I/R組明顯

6、優(yōu)于I/R組(P＜0.05);再灌注后72h,HBO+I/R組梗死面積明顯降低(P＜0.01vs. I/R組)。
　　2、重復(fù)HBO預(yù)處理對Notch信號通路的影響研究
　　2.1、Western Blotting缺血側(cè)紋狀體:結(jié)果顯示,sham組NICD表達(dá)較弱;I/R組再灌注后24h時(shí)NICD開始增高(*P＜0.05 vs. sham),再灌注72h時(shí)表達(dá)最高($P＜0.05 vs. I/R24h)。高壓氧預(yù)處理后缺血前

7、(即HBO only組)NICD表達(dá)即有明顯增加(＃P＜0.05 vs. sham)至缺血再灌注2h,24h時(shí)表達(dá)逐漸增高,而再灌注72h時(shí)表達(dá)降低;再灌注24h時(shí)表達(dá)最高(+P＜0.05 vs. HBO+I/R2h)。HBO+I/R組再灌注后2h NICD的表達(dá)高于I/R組同時(shí)間點(diǎn),而再灌注后24h,72h則反之(＃P＜0.05 HBO+I/R vs. I/R)。缺血側(cè)皮層:結(jié)果顯示,sham組NICD表達(dá)較弱;I/R組再灌注后24h

8、時(shí)NICD開始增高(*P＜0.05 vs. sham),再灌注72h時(shí)表達(dá)最高($P＜0.05 vs. I/R24h)。HBO+I/R組再灌注2h時(shí)NICD表達(dá)明顯增高(&P＜0.05 vs. sham)持續(xù)增高至再灌注24h(+P＜0.05 vs. HBO+I/R2h),再灌注72h時(shí)表達(dá)降低。HBO+I/R組再灌注2h時(shí)NICD表達(dá)高于I/R組相同時(shí)間點(diǎn)(＃P＜0.05),而再灌注后72h則反之。從總的趨勢可以看出,相對于I/R組,

9、HBO+I/R組NICD的表達(dá)高峰前移。
　　2.2、Real Time-PCR缺血側(cè)紋狀體:假手術(shù)組HES-1 mRNA水平較弱,I/R組再灌注后出現(xiàn)雙峰現(xiàn)象,分別位于再灌注2h,72h(P＜0.05 vs. sham)時(shí);再灌注72h時(shí)轉(zhuǎn)錄水平最高($P＜0.05 vs. I/R2h)。HES-1 mRNA的水平在高壓氧預(yù)處理后缺血前(即HBO only組)即有明顯增高(＃P＜0.05 vs. sham),再灌注后2h時(shí)達(dá)峰(

10、+P＜0.05 vs. HBO only& HBO+I/R24,72h),隨后逐漸降低;再灌注2h,24h時(shí)HBO+I/R組HES-1 mRNA水平高于I/R組(＃P＜0.05),而再灌注后72h時(shí)低于I/R組(＃P＜0.05)。缺血側(cè)皮層HES-1 mRNA水平變化趨勢同缺血側(cè)紋狀體。
　　2.3、免疫熒光免疫熒光雙標(biāo)記染色顯示假手術(shù)組切片NICD樣免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞較少,I/R組再灌注后24h NICD樣陽性細(xì)胞明顯增多,至72

11、h呈持續(xù)增高趨勢。而高壓氧預(yù)處理組,缺血前NICD陽性細(xì)胞即有明顯的增加,缺血再灌注后呈逐漸增加趨勢,再灌注后24h(達(dá)高峰)NICD陽性細(xì)胞最多,而再灌注后72h時(shí)陽性細(xì)胞明顯減少。
　　結(jié)論：1、大鼠局灶性腦缺血后,Notch信號通路被激活;
　　2、HBO預(yù)處理激活了Notch信號通路,并且使缺血再灌注后Notch信號相關(guān)分子NICD、HES-1表達(dá)高峰前移,提示其參與HBO預(yù)處理的腦保護(hù)效應(yīng)。
　　第二部分阻斷

12、Notch信號通路對重復(fù)HBO預(yù)處理腦保護(hù)作用影響
　　研究方法：1、驗(yàn)證抑制劑的效果雄性SD大鼠12只(280~320g)隨機(jī)分為三組(n=4):正常對照(sham)組;單純高壓氧(HBO only)組:行連續(xù)5d高壓氧;DAPT+HBO組:高壓氧預(yù)處理前3h給予50μm/L5μL DAPT。各組動(dòng)物于末次預(yù)處理后24h處死取材利用Western blotting方法檢測紋狀體NICD的水平。
　　2、阻斷Notch信號通

13、路對重復(fù)高壓氧預(yù)處理腦保護(hù)作用影響雄性SD大鼠60只(280~320g)隨機(jī)分為六組(n=10):假手術(shù)(sham)組,缺血再灌注(I/R)組,DAPT+缺血再灌注(DAPT+I/R)組,高壓氧+缺血再灌注(HBO+I/R)組,溶劑對照預(yù)處理(Vehicle+HBO+I/R)組,DAPT+預(yù)處理(DAPT+HBO+I/R)組。DAPT于每次高壓氧前3h經(jīng)側(cè)腦室給予,末次高壓氧預(yù)處理后24h,建立MCAO模型缺血2h,再灌注24,48,7

14、2h各時(shí)相點(diǎn)分別對各組進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評分,于再灌注72h斷頭取腦測定腦梗死面積。
　　結(jié)果：1、驗(yàn)證抑制劑的效果與sham和HBO only組相比,DAPT+HBO組NICD的水平明顯降低(＃P＜0.05),提示給藥成功。
　　2、阻斷Notch信號通路對重復(fù)高壓氧預(yù)處理腦保護(hù)作用影響再灌注后24,48,72h神經(jīng)功能學(xué)評分,HBO+I/R組明顯優(yōu)于DAPT+HBO+I/R組(＃P＜0.05);Vehicle+HBO+I/R

15、組與HBO+I/R組沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。再灌注后72h,DAPT+HBO+I/R組梗死面積明顯增大(＃P＜0.05 vs. HBO+I/R組);Vehicle+HBO+I/R組與HBO+I/R組沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)論：應(yīng)用Notch信號通路抑制劑DAPT可以部分逆轉(zhuǎn)HBO預(yù)處理的腦保護(hù)效應(yīng),進(jìn)一步證實(shí)Notch信號通路參與了HBO預(yù)處理的腦保護(hù)效應(yīng)。
　　小結(jié)：1、大鼠局灶性腦缺血后,Notch信號通路被激活;
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