Notch信號通路在肺間質(zhì)纖維化EMT中的作用研究.pdf

1、目的：探討Notch信號通路特異性抑制劑DAPT抑制此通路前后，在肺上皮細胞中Notch信號的激活受體Notch1、配體Jagged1；上皮細胞標記因子E鈣粘素；間質(zhì)細胞相關(guān)蛋白a-肌動蛋白的表達變化，從而探索Notch信號通路在肺纖維化上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）中的作用。進而為肺纖維化發(fā)生發(fā)展的機制提供新的線索。
　　方法：(1)用1640培養(yǎng)基培養(yǎng)肺上皮細胞株A

2、549細胞，并等量分組處理，空白對照組，TGF-βl組，TGF-βl+DAPT組，DAPT組。48小時后倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)。(2)細胞免疫熒光雙染技術(shù)檢測上皮細胞標記蛋白 E鈣粘素和間質(zhì)細胞標記蛋白a-SMA的表達。(3) western blotting檢測蛋白E鈣粘素、a-SMA、Notch1和Jagged1的表達。(4)熒光定量PCR法檢測相關(guān)蛋白的mRNA的表達。
　　結(jié)果：(1)倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)：TGF-βl可

3、使肺上皮細胞由不規(guī)則多邊形變成梭形，且細胞間連接減少，而DAPT則可減輕或逆轉(zhuǎn)這一改變。(2)細胞免疫熒光雙染顯示：TGF-βl可使E-鈣粘素表達降低甚至消失，而a-SMA表達大大增加；同時加入DAPT則可抑制這一轉(zhuǎn)化，同TGF-β1單獨作用組相比E-鈣粘素表達增加，而a-SMA表達降低；DAPT單獨作用組與空白對照組這兩種蛋白表達大致相同。(3) western blotting結(jié)果顯示：TGF-β1組中α-SMA蛋白、Notch1蛋

4、白和Jagged1蛋白的表達量較正常組、TGF-β1+DAPT組及DAPT單獨作用組明顯增加（p<0.05），而E-鈣粘素的表達量較正常組、TGF-β1+DAPT組及DAPT單獨作用組明顯減少（p<0.05），且這些蛋白在正常對照組與DAPT組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（p>0.05）。(4)熒光定量PCR檢測結(jié)果示：與空白對照組相比較， TGF-β1組E-鈣粘素mRNA在48h表達明顯減少(p<0.05)；a-SMA、Notch1和Jagg

5、ed1mRNA在48h后則明顯增加(p<0.05)；TGF-β1+DAPT組，A549細胞E-鈣粘素在48h，較TGF-β1組明顯增加(p<0.05)、a-SMA、Notch1和Jagged1 mRNA較TGF-β1組明顯減少(p<0.05)，兩者的表達都接近空白對照組；DAPT單獨作用組， E-鈣粘素、a-SMA、Notch1和Jagged1 mRNA在48h表達均接近空白對照組(p>0.05)。
　　結(jié)論：(1)TGF-βl可

6、以誘導(dǎo)肺上皮細胞轉(zhuǎn)化為纖維細胞，轉(zhuǎn)化過程中a-SMA mRNA和蛋白表達增高，而E-鈣粘素表達降低。(2)TGF-β1可使Notch信號通路的受體Notch1及配體Jagged1 mRNA和蛋白表達增高，在一定程度上激活Notch信號通路。(3)Notch信號通路特異性抑制劑 DAPT可以抑制肺上皮細胞向間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化，下調(diào) a-SMA、Notch1、Jagged1 mRNA和蛋白的表達，而上調(diào)E-鈣粘素的表達。(4)Notch信號通路可