NogO-B調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化在急性肺損傷后期肺間質(zhì)纖維化中的作用.pdf

1、背景:
　　急性肺損傷（Acute lung injury，ALI），即急性呼吸窘迫綜合癥(Acute respiratorydistress syndrome，ARDS)，是一種常見的呼吸系統(tǒng)危重癥。盡管采取了綜合的治療手段，其死亡率仍居高不下。即便是部分安全渡過急性期的病人，在其ARDS后期纖維增生階段，肺部發(fā)生成纖維細胞聚集、膠原沉積等纖維增生反應(yīng)，如無法有效逆轉(zhuǎn)，會導(dǎo)致肺間質(zhì)纖維化，使這些患者出現(xiàn)機械通氣依賴、生活質(zhì)量下降

2、等問題。而肺的纖維增生主要有三種來源:肺上皮細胞經(jīng)過上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT）形成成纖維細胞，循環(huán)成纖維細胞募集入肺，以及肺固有成纖維細胞活化增殖。網(wǎng)狀蛋白4（Reticulon4B，RTN4B），也稱軸突生長抑制劑-B（inhibitor of neurite outgrowth-B，Nogo-b），是網(wǎng)狀蛋白家族的一員，主要定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。新近研究表明，它與炎癥發(fā)生及損

3、傷修復(fù)均密切相關(guān)，在肝纖維化的發(fā)生、宮頸癌細胞HeLa細胞EMT反應(yīng)中都起到重要作用。本課題組前期研究證實，Nogo-B在肺泡上皮細胞表達，且在ALI發(fā)生發(fā)展的過程中發(fā)揮了重要作用。那么，Nogo-B在ALI后期纖維增生階段扮演怎樣的角色呢？本課題旨在明確Nogo-B在LPS誘導(dǎo)的小鼠ALI模型后期肺間質(zhì)纖維化的作用，以期為明確該疾病的發(fā)生發(fā)展機制乃至為治療策略的制定有所幫助。
　　方法:
　　一、體內(nèi)實驗
　　（一）

4、實驗對象:野生型C57BL/6小鼠及Nogo-B敲除小鼠，6-8周，雄性。
　?。ǘ┰炷＜胺纸M:通過脂多糖(lipopolusaccharide，LPS)氣管滴入構(gòu)建小鼠的ALI模型，以等量磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）滴入構(gòu)造正常對照模型。隨機分組，收集正常對照組、造模第一天組、造模第四天組、造模第七天組及造模第十天組小鼠的肺組織標(biāo)本。
　?。ㄈz測方法:通過病理切片、Mass

5、on染色、免疫組化、實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time quantitiative PCR，rt-qPCR)、蛋白印跡試驗(Westem Blot，WB)等檢測Nogo-B在ARDS中的表達變化，明確Nogo-B是否參與ARDS后期的纖維增生的過程。同時，檢測纖維增生主要誘導(dǎo)因子轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β，TGFβ)以及標(biāo)志分子上皮鈣黏蛋白（E-cadherin）、平滑肌肌動蛋白α(

6、α-smoothmuscle actin，α-SMA)、波形蛋白(Vimentin)表達變化，明確ALI模型后期是否發(fā)生肺間質(zhì)纖維化，以及Nogo-B的敲除是否會對纖維增生反應(yīng)有所影響。
　　二、體外實驗:
　?。ㄒ唬┭芯繉ο?小鼠肺泡上皮細胞株(MLE-12)
　?。ǘ┰炷＜胺纸M:選用小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）干擾建立Nogo-B低表達MLE組，設(shè)立空白對照組及陰性對照組

7、(Negtive siRNA)，并通過TGFβ1誘導(dǎo)MLE細胞EMT反應(yīng)，收集細胞蛋白及RNA。
　?。ㄈz測方法:通過rt-qPCR、WB對比Nogo-B低表達MLE組與對照組在TGFβ1誘導(dǎo)下Nogo-B表達變化，及EMT反應(yīng)中上皮及間質(zhì)分子標(biāo)記表達變化，進一步明確Nogo-B在其中的作用。
　　結(jié)果:
　　一、小鼠急性肺損傷模型中Nogo-B表達變化及其與后期肺間質(zhì)纖維化形成的關(guān)聯(lián)性研究
　　LPS誘導(dǎo)小

8、鼠ALI模型的病理切片顯示，造模第一天小鼠肺部炎癥較重，第四天炎癥反應(yīng)逐漸減輕而纖維化加重，至第七天和第十天，炎癥基本消退而肺纖維化明顯。而正常對照組小鼠既有少量Nogo-B表達，造模第一天明顯下降，第四天后逐漸增高，高表達持續(xù)至第七天，與纖維增生反應(yīng)發(fā)生的時間趨勢一致。同時，在造模第一天，纖維增生反應(yīng)主要誘導(dǎo)因子TGFβ即釋放增加，上皮表面標(biāo)記E-cadherin表達明顯下降，而隨著時間推進，上皮細胞位置逐漸出現(xiàn)間質(zhì)細胞表面分子α-S

9、MA及Vimentin表達。第七及第十天TGFβ持續(xù)表達較高，E-cadherin表達明顯下降而α-SMA及Vimentin表達增高。結(jié)果提示Nogo-B與肺間質(zhì)纖維化的發(fā)生相關(guān)。
　　二、調(diào)控Nogo-B表達對小鼠急性肺損傷模型炎癥反應(yīng)及后期肺間質(zhì)纖維化的影響
　　LPS誘導(dǎo)的Nogo-B敲除小鼠與野生型小鼠相比，正常對照組肺組織切片表現(xiàn)基本一致，而造模第一天敲除鼠炎癥程度明顯較野生型重，至第七天仍有部分炎癥反應(yīng)而野生型小

10、鼠炎癥基本吸收，而第十天與正常組小鼠相比，纖維化程度較正常小鼠輕。同時，在ALI發(fā)生發(fā)展過程中，敲除鼠與野生型小鼠相比，TGFβ表達變化基本一致，而第七天及第十天α-SMA及Vimentin表達較低，提示Nogo-B敲除小鼠雖然經(jīng)歷更重的炎癥反應(yīng)，但是后期纖維化反應(yīng)減輕。
　　三、調(diào)控Nogo-B表達對小鼠急性肺損傷模型后期肺間質(zhì)纖維化影響的可能的機制探討
　　已有文獻表明，在肺間質(zhì)纖維化的過程中EMT反應(yīng)在其中起到了重要作

11、用。通過對MLE-12細胞進行siRNA干擾Nogo-B表達和TGFβ1誘導(dǎo)EMT反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)，TGFβ1誘導(dǎo)下Nogo-B表達明顯升高，而進行Nogo-B干擾發(fā)現(xiàn)，干擾組上皮細胞上皮表面標(biāo)記E-cadherin表達較未干擾組較高而間質(zhì)細胞表面標(biāo)記α-SMA及Vimentin表達較低，提示下調(diào)Nogo-B影響了TGFβ對細胞EMT的誘導(dǎo)。通過對主要信號通路分子進行檢測發(fā)現(xiàn)，下調(diào)Nogo-B組Smad2磷酸化水平下降，說明Nogo-B能通過

12、干擾TGFβ/Smad2通路影響MLE細胞的EMT反應(yīng)。
　　結(jié)論:
　　一、在LPS誘導(dǎo)的小鼠ALI模型中，后期發(fā)生了肺間質(zhì)纖維化，并且Nogo-B參與了LPS誘導(dǎo)小鼠ALI過程中的炎癥發(fā)生及纖維增生反應(yīng)。
　　二、Nogo-B敲除鼠與野生型小鼠相比，前期炎癥反應(yīng)較重而后期纖維化較輕，進一步證實了Nogo-B的存在對LPS誘導(dǎo)小鼠ALI模型中的炎癥及肺間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展有保護性作用。
　　三、Nogo-B可以