Nogo-B在急性肺損傷肺泡上皮細胞凋亡中的作用.pdf

1、背景:
　　急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory dirstress syndrome，ARDS）在臨床上表現(xiàn)為雙肺彌漫浸潤、肺順應(yīng)性下降、進行性及頑固性低氧血癥，而肺部病理改變主要為血管擴張以及肺透明膜形成等。眾所周知，ARDS是臨床急危重癥，而急性肺損傷（acute lung injury）通常認為是ARDS的早期表現(xiàn)，或是ARDS較輕的表現(xiàn)形式。在2012年的ARDS柏林標準中已將ALI其歸入ARDS中。A

2、RDS的發(fā)病率約為每年86.2/100000人次，有著相當高病死率，約為38.5％。膿毒癥是與ARDS最為密切相關(guān)的危險因素中，也是ARDS最常見的病因。膿毒癥所致的ARDS與細菌細胞壁組分脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)密切相關(guān)，因而很多有關(guān)ALI/ARDS的研究均使用LPS作為動物或細胞學(xué)研究制造模型的工具。迄今為止，人們已經(jīng)嘗試了很多種藥物及輔助治療手段對ARDS進行治療，但其中獲得陽性結(jié)果的治療手段寥寥無幾

3、，而藥物治療更是無一能夠證實可改善該病的死亡率。這種臨床的現(xiàn)實迫使我們對ARDS的發(fā)病機制及發(fā)展過程進行深入研究，從中發(fā)掘出潛在的治療靶點及手段，以期將來某一天能攻克這一疾病。在病理生理學(xué)上，目前認為ARDS是機體遭受大量致病因素打擊后所產(chǎn)生的廣泛肺損傷。肺血管內(nèi)皮-肺泡上皮屏障的受損在這種肺損傷中占據(jù)重要地位，肺血管內(nèi)皮-肺泡上皮屏障受損導(dǎo)致其通透性增加，進而導(dǎo)致富含蛋白的滲出液-肺泡上皮屏障通透性增加還導(dǎo)致炎癥細胞如白細胞等聚集于肺

4、泡腔內(nèi)加重炎癥反應(yīng)，這是ARDS時的核心病理生理變化。肺泡上皮細胞是構(gòu)筑該屏障的重要組分，研究發(fā)現(xiàn)肺泡上皮細胞的過度凋亡與ALI/ARDS的發(fā)病相關(guān)。Nogo-B又稱為網(wǎng)狀蛋白4B，是近年來發(fā)現(xiàn)的具有調(diào)控炎癥、組織修復(fù)等多種功能的一種蛋白質(zhì)，定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。進一步研究發(fā)現(xiàn)Nogo-B可通過參與調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激調(diào)控細胞的凋亡。現(xiàn)已證實Nogo-B在多種上皮細胞中均有表達，本實驗室的前期研究也發(fā)現(xiàn)Nogo-B可表達于肺泡上皮細胞中。那么在LP

5、S所致的肺泡上皮損傷過程中，Nogo-B究竟扮演一個怎樣的角色，其是否并且如何參與到這個過程中目前并無相關(guān)報道。
　　方法:
　　首先我們通過LPS氣管腔內(nèi)滴注的方法構(gòu)建小鼠ALI模型，分別使用反轉(zhuǎn)錄和實時定量熒光PCR的方法以及蛋白免疫印跡試驗的方法觀察Nogo-B mRNA及蛋白在該模型肺組織中的表達變化情況，同時使用LPS刺激的MLE-12及A549細胞株進行細胞學(xué)研究。通過這些實驗我們的目的是明確和了解Nogo-B是

6、否有可能參與到ALI/ARDS的發(fā)病及發(fā)展過程中。
　　其次，我們分別使用Nogo-B基因敲除小鼠和野生型小鼠再次復(fù)制構(gòu)建小鼠ALI模型，對兩組小鼠生存時間進行生存分析，繪制生存曲線。并對這兩種小鼠模型肺組織肺泡灌洗液總蛋白濃度以及肺組織濕/干重比這兩項炎癥指標進行檢測，同時留取小鼠肺組織做石蠟切片、HE染色進行病理學(xué)觀察，通過對比以上觀測指標，進一步了解Nogo-B基因敲除與否對小鼠ALI的病理生理學(xué)影響及其程度，確認Nogo-

7、B是否真正參與了ALI/ARDS的病理生理學(xué)過程。
　　再次，為明確Nogo-B對ALI/ARDS時肺泡上皮細胞損傷的影響是否是通過影響和調(diào)控其凋亡過程來達成的，我們使用凋亡細胞的原位末端轉(zhuǎn)移酶標記法（TUNEL）對Nogo-B基因敲除小鼠及野生型小鼠肺組織石蠟切片進行染色。通過觀察對比，了解Nogo-B基因敲除對ALI時肺內(nèi)細胞凋亡的影響。此后我們再對Caspase-3活性及其活性蛋白片段表達的檢測對上述凋亡進行量化及分析。為進

8、一步明確Nogo-B對上皮細胞凋亡的影響，我們在MLE-12細胞株上進行小干擾RNA敲減及LPS刺激實驗，重復(fù)上述對Caspase-3活性及其活性蛋白片段表達量的檢測與分析。
　　最后，為明確Nogo-B是否通過調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激進而調(diào)控ALI時肺泡上皮細胞凋亡，我們在MLE-12細胞上進行了研究。通過對比小干擾RNA敲減Nogo-B表達與未敲減Nogo-B表達細胞之間Caspase-8、9的表達變化，明確Nogo-B對肺泡上皮細胞的

9、凋亡影響是在內(nèi)源性細胞凋亡通路上還是在外源性細胞凋亡通路上。為明確Nogo-B是否通過調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激最終影響細胞凋亡的過程，我們選擇一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活劑——衣霉素對細胞進行干預(yù)，通過對比分析上述兩種不同Nogo-B表達水平細胞暴露于不同濃度衣霉素之下后再遭受LPS刺激后Caspase-3、8、9以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標記GRP78的蛋白表達變化，最終明確Nogo-B是否通過調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與到ALI時肺泡上皮細胞的凋亡過程中。
　　結(jié)果:

10、
　　一、ALI動物模型和肺泡上皮細胞損傷中Nogo-B mRNA及蛋白質(zhì)變化
　　實時定量熒光PCR結(jié)果顯示Nogo-B mRNA在ALI小鼠模型中表達呈下降趨勢。Nogo-B蛋白表達情況與mRNA表達情況一致，亦是在LPS氣管內(nèi)滴注造模后呈下降趨勢。通過這兩項檢測，我們可以明確在小鼠ALI模型中，Nogo-B mRNA及Nogo-B蛋白的表達均發(fā)生了變化，其變化趨勢是在ALI造模后呈逐漸下降的趨勢，并且在12～48小時內(nèi)

11、其下降到一個比較明顯的范圍，統(tǒng)計分析也顯示在此時間段內(nèi)無論是mRNA水平還是蛋白質(zhì)水平，Nogo-B的表達下降均有統(tǒng)計學(xué)意義。在上述兩種細胞中Nogo-B mRNA表達量在0-48小時的時間范圍內(nèi)均呈下降趨勢，但兩種細胞株的下降的水平并不完全相同。與mRNA結(jié)果一致，在兩種細胞株接受LPS刺激后，Nogo-B蛋白表達量也呈隨時間下降的趨勢。
　　二、Nogo-B對小鼠急性肺損傷的保護作用
　　生存分析顯示，在使用致死劑量LP

12、S造模后，Nogo-B基因敲除小鼠在6小時即出現(xiàn)第一只死亡的小鼠，而野生型小鼠在第22小時開始出現(xiàn)第一只死亡小鼠。Nogo-B基因敲除小鼠絕大部分在ALI造模后的20小時內(nèi)死亡，而野生型小鼠的死亡時間集中于ALI造模后20至40小時內(nèi)。BALF總蛋白測定的結(jié)果顯示Nogo-B基因敲除小鼠BALF總蛋白含量明顯高于野生型小鼠，提示Nogo-B基因敲除小鼠肺血管內(nèi)皮-肺泡上皮屏障破壞的程度高于野生型小鼠。同時肺組織濕/干重比測定的結(jié)果也與B

13、ALF總蛋白的變化相吻合，野生型小鼠肺濕/干重比例低于Nogo-B基因敲除小鼠。小鼠肺組織HE染色則發(fā)現(xiàn)Nogo-B基因敲除小鼠氣管腔內(nèi)滴注LPS后肺泡間隔破壞、肺泡出血情況明顯重于野生型C57BL/6小鼠。而在使用PBS氣管腔內(nèi)滴注作為對照的Nogo-B基因敲除小鼠與野生型小鼠的對比中，以上三項指標均未出現(xiàn)明顯的變化。
　　三、Nogo-B對急性肺損傷中肺泡上皮細胞凋亡的影響
　　使用TUNEL染色觀察到Nogo-B基因敲

14、除ALI小鼠肺組織內(nèi)肺泡上皮細胞凋亡遠遠重于野生型ALI小鼠。而使用氣管腔內(nèi)滴注PBS的對照組小鼠并未出現(xiàn)明顯的改變。ALI造模后，小鼠肺組織Caspase-3活性從呈逐漸上升的趨勢，在12至48小時的時間段內(nèi)，是其增加的高峰位置。使用Western Blot方法檢測ALI造模后不同時間點小鼠肺組織內(nèi)Caspase-3活性片段也顯示出類似的結(jié)果。敲減Nogo-B表達后并使用LPS刺激后24小時，MLE細胞Caspase-3活性以及Cas

15、pase-3活性片段蛋白表達均明顯高于PBS對照組。而在敲減Nogo-B表達的細胞中，LPS刺激后Caspase-3活性及Caspase-3活性片段蛋白表達量是最高的，且其與單純用LPS刺激的細胞相比其升高具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　四、Nogo-B調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對肺泡上皮細胞凋亡的影響
　　使用LPS刺激細胞后24小時，MLE-12細胞株中Caspase-8活性片段表達較PBS對照組明顯升高，而使用SiRNA敲減Nogo-B基因

16、表達組其Caspase-8活性片段表達高于陰性SiRNA組。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標志GRP78在ALI小鼠肺組織中表達呈隨時間進展逐步上升的趨勢，在24-48小時的時間段內(nèi)較為明顯，而在LPS刺激的MLE-12細胞株中，GRP78蛋白的變化趨勢與之類似。Nogo-B基因敲減表達+LPS刺激與單獨衣霉素刺激對凋亡及ERS的影響是一致的，兩者均使得Caspase-3活性片段和GRP78蛋白表達上升，而Caspase-9活性片段蛋白表達變化不大。而且N

17、ogo-B基因敲減表達+LPS刺激+衣霉素暴露組中，其GRP78及Caspase-3活性片段表達有高于以上兩組的趨勢。
　　結(jié)論:
　　一、LPS氣管腔內(nèi)滴注所致的ALI小鼠模型肺組織中Nogo-B表達下降，LPS刺激的MLE及A549細胞中Nogo-B表達下降。因而可以Nogo-B在ALI中的表達出現(xiàn)了明顯的變化趨勢，提示其可能參與了ALI的病理生理過程。
　　二、敲除Nogo-B基因可使小鼠在氣管腔內(nèi)滴注LPS造模

18、后生存時間縮短，并且敲除Nogo-B基因可使ALI小鼠肺組織損傷程度加重。這進一步證實了Nogo-B在ALI的病理生理過程中發(fā)揮了一定的作用，可以明確Nogo-B的確參與了ALI的發(fā)病。
　　三、敲除Nogo-B基因可使ALI小鼠肺泡上皮細胞凋亡增加，SiRNA敲減Nogo-B表達可使MLE-12細胞株在暴露于LPS刺激后凋亡增加。這些實驗結(jié)果則明確了敲除Nogo-B可使ALI時肺泡上皮細胞凋亡增加，反過來Nogo-B有保護ALI