丹參酮ⅡA抑制肺間質(zhì)纖維化的機制研究.pdf

1、特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化（Idiopathic Pulmonary Fibrosis，IPF）嚴重威脅人類健康和生命，是最難治的慢性纖維化性肺部疾病，其發(fā)病率呈逐漸上升趨勢，死亡率高。但因發(fā)病機制至今仍不明確，目前尚無有效的治療方法。2011指南指出肺移植是目前唯一有效的治療辦法，尚沒發(fā)現(xiàn)哪種藥物對IPF有效，研究提示某些藥物對IPF患者可能有益。因此，繼續(xù)尋找有效的治療IPF的藥物仍是目前研究之重。
　　丹參是一種經(jīng)典傳統(tǒng)中藥，對活血

2、化淤有效，從丹參中提取的脂溶性活性成分之一丹參酮ⅡA(TanshinoneⅡA)是目前研究較多的一種單體成分，主要因為丹參酮ⅡA是眾多丹參酮成分中最為穩(wěn)定的有效活性成分，且其含量最高，分子結(jié)構(gòu)明確，具有丹參的大部分藥物效應(yīng)，在臨床上常用于心血管病的治療。
　　通過對丹參酮ⅡA抑制TGF-β依賴的EMT過程的體內(nèi)體外研究，發(fā)現(xiàn)丹參酮ⅡA抑制博來霉素誘導(dǎo)的肺巨噬細胞增加、膠原沉積、EMT過程及TGF-β/Smad信號通路的激活。體外實

3、驗也證實丹參酮ⅡA抑制A549細胞中TGF-β信號通路以及EMT，但是丹參酮ⅡA是通過哪些途徑起到這樣的作用尚不清楚，Caveolin-1是TGF-β信號通路的上游因子，在肺纖維化過程中，Caveolin-1的表達下降;增加Caveolin-1的表達可以抑制TGF-β信號通路，達到一定程度抑制肺纖維化的目的，因此，既然Caveolin-1和丹參酮ⅡA都有抑制TGF-β信號通路的作用，我們是否可以猜想丹參酮ⅡA抑制肺纖維化的作用可能與Ca

4、veolin-1有關(guān)呢？我們主要通過體外實驗研究丹參酮ⅡA是否通過Caveolin-1調(diào)控下游的TGF-β/Smad信號通路介導(dǎo)的EMT過程，從而達到抑制肺纖維化目的？為臨床新藥開發(fā)提供更多的理論基礎(chǔ)。
　　第一部分 丹參酮ⅡA抑制博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化
　　目的:探討丹參酮ⅡA對肺纖維化大鼠的肺組織形態(tài)學(xué)變化及Ⅰ型膠原、羥脯氨酸含量、CD68表達的影響，以明確丹參酮ⅡA對肺間質(zhì)纖維化有無保護作用。
　　方法:清潔級S

5、D大鼠，體重約250g，采用隨機數(shù)字表法分為對照組（Control），丹參酮ⅡA組(TanⅡA)，纖維化組(BLM)，丹參酮ⅡA+纖維化(BLM+TanⅡA)，每組6只。各組干預(yù)28天，處死所有大鼠，取肺組織，計算肺組織的濕/干重比，對肺組織進行石蠟包埋后行組織病理學(xué)檢測及ELISA檢測各組大鼠肺組織中的Ⅰ型膠原及羥脯氨酸含量，通過免疫組織化學(xué)方法檢測肺巨噬細胞標志物CD68的表達。
　　結(jié)果:丹參酮ⅡA+纖維化組的大鼠肺濕/干重

6、比明顯低于纖維化組;HE染色可見丹參酮ⅡA+纖維化組與纖維化組比較肺泡間隔纖維增生灶較少，累及病變范圍較小，肺實質(zhì)結(jié)構(gòu)破壞較少，Masson染色提示膠原纖維減少;纖維化組Ⅰ型膠原及羥脯氨酸含量、CD68表達與對照組比較明顯升高，丹參酮ⅡA+纖維化組與纖維化組比較Ⅰ型膠原及羥脯氨酸含量、CD68表達下降。
　　結(jié)論:丹參酮ⅡA抑制博來霉素誘導(dǎo)的大鼠肺組織肺泡巨噬細胞標志物CD68表達，減輕炎癥反應(yīng);丹參酮ⅡA抑制Ⅰ型膠原及羥脯氨酸含

7、量，減少細胞外基質(zhì)沉積，減輕肺纖維化。
　　第二部分 丹參酮ⅡA抑制TGF-β依賴的EMT機制研究
　　目的:研究丹參酮ⅡA對博來霉素誘導(dǎo)肺纖維化大鼠肺組織及TGF-β1刺激的A549細胞EMT生成及TGF-β/Smad通路的影響，進一步探討丹參酮ⅡA改善肺間質(zhì)纖維化的作用機制。
　　方法:體內(nèi)實驗分為對照組(Control)，丹參酮ⅡA組(TanⅡA)，纖維化組(BLM)，丹參酮ⅡA+纖維化組(BLM+TanⅡA)，

8、每組6只。各組干預(yù)28天，處死所有大鼠，取肺組織;體外實驗分為4組:對照組(Control):10μM的DMSO;丹參酮ⅡA組(TanⅡ A):10μM的丹參酮ⅡA; TGF-β1組(TGF-β1):10μM的DMSO+10ng/ml的TGF-β1;丹參酮ⅡA+TGF-β1(TGF-β1+TanⅡA):10μM的丹參酮ⅡA+10ng/ml的TGF-β1。通過免疫熒光方法檢測各組大鼠肺組織及各組細胞E-cadherin的表達;Real-t

9、ime PCR檢測各組大鼠肺組織TGF-β1RNA水平的表達;Westem blotting檢測各組大鼠肺組織及各組細胞TGF-β1、Smad2、p-Smad2、Smad3、p-Smad3、E-cadherin、α-SMA、Fibronectin和Vimentin蛋白水平的表達。
　　結(jié)果:免疫熒光染色檢測結(jié)果提示纖維化組與對照組及丹參酮ⅡA組比較，E-cadherin的陽性染色減少，丹參酮ⅡA預(yù)處理后E-cadherin的表達被

10、部分恢復(fù);Western blotting及Real-time PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)纖維化組、TGF-β1組分別與對照組比較，E-cadherin表達明顯下降，α-SMA、Fibronectin和Vimentin蛋白表達明顯升高，TGF-β1RNA及蛋白表達、p-Smad2、p-Smad3表達均升高，加入丹參酮ⅡA干預(yù)性治療組上述因子表達均被逆轉(zhuǎn)，差異有顯著性。而且丹參酮ⅡA對Smad2、Smad3的表達無影響，僅能影響Smad2、Smad3

11、的磷酸化水平。
　　結(jié)論:丹參酮ⅡA通過抑制博來霉素誘導(dǎo)的肺組織EMT及TGF-β/Smad信號通路的激活，減輕肺纖維化;丹參酮ⅡA抑制TGF-β1刺激的A549細胞TGF-β信號依賴的EMT形成。
　　第三部分 丹參酮ⅡA通過上調(diào)Caveolin-1抑制TGF-β1刺激的A549細胞EMT
　　目的:進一步體外實驗探討丹參酮ⅡA是否通過Caveolin-1調(diào)控下游TGF-β/Smad信號通路及EMT過程，為丹參酮ⅡA

12、應(yīng)用于臨床，開發(fā)新藥提供更多的理論基礎(chǔ)。
　　方法:我們首先用Western blotting檢測第二部分四組細胞Caveolin-1蛋白水平表達。然后構(gòu)建并篩選了轉(zhuǎn)染效率高的Caveolin-1特異性shRNA表達載體用于細胞轉(zhuǎn)染，共分為7組:對照組(A);丹參酮ⅡA組(B):10μM的丹參酮ⅡA處理2h;Caveolin-1 shRNA+丹參酮ⅡA(C):轉(zhuǎn)染Caveolin-1 shRNA24h，然后用10μM的丹參酮ⅡA處

13、理2h;TGF-β1(D):10ng/ml的TGF-βl處理48h;Caveolin-1shRNA+TGF-β1(E):轉(zhuǎn)染Caveolin-1 shRNA24h，然后用10ng/ml的TGF-β1處理48h;丹參酮ⅡA+TGF-β1(F):10μM的丹參酮ⅡA處理2h，然后用10ng/ml的TGF-β1處理48h; Caveolin-1 shRNA+丹參酮ⅡA+TGF-β1(G):轉(zhuǎn)染Caveolin-1shRNA24h，然后用10μ

14、M的丹參酮ⅡA處理2h，再用10ng/ml的TGF-β1處理48h。RT-PCR及Western blotting檢測各組細胞TGF-β1、E-cadherin、Fibronectin和Vimentin RNA及蛋白水平表達。Western blotting檢測各組細胞p-Smad2、p-Smad3表達。
　　結(jié)果:TGF-β1組與對照組及丹參酮ⅡA組比較Caveolin-1的表達水平明顯下降，經(jīng)過丹參酮ⅡA預(yù)處理后Caveoli

15、n-1的表達明顯升高，說明丹參酮ⅡA在纖維化過程中影響了Caveolin-1的表達;RT-PCR及Western blotting均提示丹參酮ⅡA（B組）與對照組（A組）比較TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3、E-cadherin、Fibronectin、Vimentin的表達變化不明顯，但轉(zhuǎn)染Caveolin-1 shRNA（C組）后，TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3表達升高，上皮細胞標志物E-cadherin表

16、達下降，而間質(zhì)細胞標志物Fibronectin與Vimentin表達升高;A549細胞轉(zhuǎn)染Caveolin-1 shRNA24 h后，10ng/ml TGF-β1處理細胞48h（E組）與僅接受TGF-βl處理48h（D組）比較，Caveolin-1 shRNA+丹參酮ⅡA+TGF-β1（G組）與丹參酮ⅡA+TGF-β1(F組)比較，TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3表達升高，E-cadherin的表達明顯下降，F(xiàn)ibronec