丹參酮ⅡA抑制瘢痕疙瘩的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、一、研究背景
　　 瘢痕疙瘩是一種持續(xù)生長(zhǎng)并超出原皮膚創(chuàng)緣的病理性瘢痕，以成纖維細(xì)胞的不斷增殖及細(xì)胞外基質(zhì)特別是膠原的過度沉積為特征，被視為人類獨(dú)有的真皮成纖維細(xì)胞腫瘤。瘢痕疙瘩不僅僅影響美觀，而且常伴有瘙癢和疼痛感等局部癥狀，甚至導(dǎo)致局部功能障礙，給患者的生理和精神上都帶來了巨大的痛苦。
　　 瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞與其他正常成纖維細(xì)胞相比，其Ⅰ型膠原及纖維粘連蛋白過度表達(dá)以及膠原多肽的降解降低導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積;VE

2、GF、TGF-β1、TGF-β2等生長(zhǎng)因子及PDGF-α受體等生長(zhǎng)因子受體的過度表達(dá)，同時(shí)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞對(duì)生長(zhǎng)因子的刺激反應(yīng)敏感;瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增生及凋亡失衡，瘢痕疙瘩組織中成纖維細(xì)胞的凋亡率要明顯低于正常皮膚組織中成纖維細(xì)胞。這些差異都是引起瘢痕疙瘩形成的重要原因。
　　 瘢痕疙瘩是整形科常見疾病，但也是臨床工作所面臨的治療難點(diǎn)，現(xiàn)常采用手術(shù)切除、激光治療、類固醇藥物注射、硅凝膠治療、放射治療、5-氟尿嘧啶注射等治療方

3、法的綜合運(yùn)用，這些方法取得了一定的療效，但也存在各自的不足，因此至今尚缺乏瘢痕疙瘩的理想治療方法。
　　 現(xiàn)常用的瘢痕疙瘩治療方法中，5-氟尿嘧啶注射治療、激光治療、皮質(zhì)類固醇激素注射及射線治療的治療原理之一即是誘導(dǎo)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞凋亡，抑制其增殖。有研究者提出，現(xiàn)今瘢痕疙瘩治療效果欠佳也與細(xì)胞凋亡有關(guān)，一方面是人為誘導(dǎo)凋亡仍然不足，另一方面是可能是誘導(dǎo)凋亡過度，導(dǎo)致其他種類細(xì)胞死亡，引發(fā)新的修復(fù)后，而造成延遲性的增生?？梢?，

4、尋找瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞凋亡缺陷機(jī)制以及有效誘導(dǎo)其凋亡對(duì)瘢痕疙瘩治療具有重要意義。
　　 近年來，在中藥或中藥提取物治療瘢痕疙瘩的研究方面取得了一定的進(jìn)展。研究指出丹參與黃芪的混合提取物(CASE)可通過調(diào)節(jié)TGF-β/Smad通路，抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖、侵襲及膠原合成的作用，但CASE具體有效成分并不十分明確。
　　 CASE主要成分之一的丹參是具有很多藥理作用的活血化瘀藥，主要成份包括丹參酮(Ⅰ、ⅡA、ⅡB)、異

5、丹參酮(Ⅰ、Ⅱ)等。其中，而丹參酮ⅡA是丹參中主要有效成分之一，其標(biāo)準(zhǔn)品穩(wěn)定易得。丹參酮ⅡA含有醌型結(jié)構(gòu)，易被氧化還原，可參與機(jī)體的多種生化反應(yīng)而有多種生物活性。
　　 近來研究發(fā)現(xiàn)，丹參酮ⅡA可誘導(dǎo)多種人類腫瘤細(xì)胞的凋亡，可誘導(dǎo)白血病THP-1細(xì)胞、人肝癌細(xì)胞、人宮頸癌細(xì)胞、人乳腺癌細(xì)胞以及人結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的作用。并且有報(bào)道指出，兔耳增生性瘢痕模型中，丹參酮ⅡA對(duì)兔耳增生性瘢痕有明顯的抑制作用;丹參酮ⅡA具有抑制膽管來源成纖維

6、細(xì)胞增殖及膠原的分泌，誘導(dǎo)MMP-9mRNA的表達(dá)而促進(jìn)膠原降解，抑制膽道瘢痕的形成的作用?？紤]丹參酮ⅡA可能對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞也具有同樣的抑制增殖，誘導(dǎo)凋亡的作用，可用于瘢痕疙瘩的治療。
　　 由于瘢痕疙瘩是人類所特有的病理性瘢痕，至今尚無理想的瘢痕疙瘩動(dòng)物模型，因而增加了瘢痕疙瘩的研究難度?，F(xiàn)瘢痕疙瘩動(dòng)物模型的建立主要有以下三種:①在動(dòng)物身上誘導(dǎo)出類似瘢痕疙瘩的瘢痕增生模型;②將人的瘢痕疙瘩移植于免疫缺陷動(dòng)物體內(nèi);③應(yīng)用組

7、織工程的原理和方法構(gòu)建人瘢痕疙瘩動(dòng)物模型。
　　 第一種動(dòng)物模型的瘢痕增生程度和人體瘢痕差距明顯，該模型仍存在很多爭(zhēng)論，治療評(píng)價(jià)研究所得結(jié)果可信度受到影響;第三種應(yīng)用組織工程的原理和方法構(gòu)建人瘢痕疙瘩動(dòng)物模型的方法尚不十分成熟，相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道不多，還需進(jìn)一步研究探討，第二種動(dòng)物模型自1985年，Shetlar首次報(bào)道，隨后Estrem及Kischer等人進(jìn)行了類似的研究，證實(shí)了該動(dòng)物模型的可行性。此后，我國(guó)學(xué)者在此基礎(chǔ)上也開展了進(jìn)

8、一步的研究。他們研究發(fā)現(xiàn)，裸鼠瘢痕疙瘩模型中移植于裸鼠皮下的瘢痕疙瘩組織能基本保持原有的組織學(xué)形態(tài)和生物學(xué)形態(tài)，具有較好的可操作性和可復(fù)制性。并且在裸鼠的瘢痕疙瘩模型建立過程中，保留表皮的裸鼠瘢痕疙瘩模型更能維持瘢痕疙瘩原有的生物學(xué)特性。并有研究明確指出，瘢痕疙瘩組織植入后的1～4周是良好的實(shí)驗(yàn)干預(yù)時(shí)機(jī)，是一個(gè)相對(duì)理想的瘢痕疙瘩模型。
　　 二、研究目的
　　 本實(shí)驗(yàn)研究是體外培養(yǎng)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞后，給予丹參酮ⅡA干預(yù)

9、，并與對(duì)照組進(jìn)行比較，觀察體外培養(yǎng)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞細(xì)胞增殖，細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的變化，探討丹參酮ⅡA對(duì)體外培養(yǎng)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞細(xì)胞的影響。將瘢痕疙瘩組織塊植入裸鼠皮下，制作瘢痕疙瘩裸鼠模型，觀察該動(dòng)物模型的可靠性，并于裸鼠腹腔注射丹參酮ⅡA，與對(duì)照組進(jìn)行比較，觀察瘢痕疙瘩組織塊的大體形態(tài)變化，組織學(xué)形態(tài)變化，特別是細(xì)胞凋亡情況。
　　 三、方法
　　 1.實(shí)驗(yàn)組織來源:所用瘢痕疙瘩組織均取自上海交通大學(xué)附屬上海市第九

10、人民醫(yī)院整形外科的17例瘢痕疙瘩患者。術(shù)前患者符合瘢痕疙瘩的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，術(shù)后病理證實(shí)與臨床診斷一致。且患者無長(zhǎng)時(shí)間外用瘢痕防治藥物史，不伴有腫瘤及其他嚴(yán)重疾病。
　　 2.體外培養(yǎng)人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)所用的細(xì)胞為第1～2代細(xì)胞。
　　 3.體外培養(yǎng)細(xì)胞干預(yù)實(shí)驗(yàn)分組:本部分實(shí)驗(yàn)采用析因設(shè)計(jì)分組，按照干預(yù)濃度分別為(0ug/ml、50ug/ml、100ug/ml、200ug/ml)，于不同干預(yù)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行觀察細(xì)胞增殖，

11、凋亡及周期情況變化，并以0ug/ml組作為對(duì)組進(jìn)行比較。每組樣本量3-4例。
　　 4.CCK-8比色法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并測(cè)定瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖情況。
　　 5.流式細(xì)胞術(shù)AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測(cè)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞凋亡情況，比較細(xì)胞早期凋亡率的差別。
　　 6.流式細(xì)胞術(shù)PI法DNA染色檢測(cè)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的細(xì)胞周期情況，比較G0/G1期細(xì)胞比例的差別。
　　 7.瘢痕疙瘩裸鼠移植模

12、型的制作:將手術(shù)切取的瘢痕疙瘩組織，無菌條件下制成保留表皮的組織塊，大小均為8mm×5mm×5mm，植入裸鼠右側(cè)肩胛皮下腔隙內(nèi)。
　　 8.瘢痕疙瘩裸鼠模型干預(yù)實(shí)驗(yàn)分組及給藥方法:15只裸鼠模型在瘢痕疙瘩組織塊植入后第16天，從中隨機(jī)抽取3只裸鼠，對(duì)植入的瘢痕疙瘩組織的進(jìn)行大體形態(tài)觀察及組織學(xué)觀察，以明確瘢痕疙瘩組織塊植入第16天后組織的血供及組織存活情況;另外12只隨機(jī)分成2組，每組各6只。一組為實(shí)驗(yàn)組，腹腔注射丹參酮ⅡA5m

13、g;一組為對(duì)照組，腹腔注射等量生理鹽水，兩組均連續(xù)注射14天后處死裸鼠，取出植入的瘢痕疙瘩組織，對(duì)植入的瘢痕疙瘩組織的進(jìn)行大體形態(tài)觀察及組織學(xué)觀察。
　　 9.瘢痕疙瘩組織的大體形態(tài)觀察，觀察植入組織塊表面的血管情況，有無組織的萎縮壞死，并測(cè)量組織塊大小。
　　 10.瘢痕疙瘩組織石蠟切片后HE染色和Masson三色法染色進(jìn)行組織學(xué)觀察
　　 11.瘢痕疙瘩組織冰凍切片后Tunel法凋亡細(xì)胞染色觀察
　　

14、 12.數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法:用SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)用x±s表示。細(xì)胞增殖活性、細(xì)胞早期凋亡率和G0/G1期細(xì)胞比例的比較采用析因設(shè)計(jì)方差分析，兩兩比較采用LSD法;瘢痕疙瘩組織塊體積大小的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)的方法，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)。
　　 四、結(jié)果
　　 1.CCK-8比色法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，其決定系數(shù)R2=0.96，回歸方程為Y=-359.51+15211.73X(Y為瘢痕疙瘩成

15、纖維細(xì)胞數(shù)，X為測(cè)得的OD值)。對(duì)方程進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)顯示，該方程具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CCK-8比色法測(cè)得的OD值可以很好的反應(yīng)實(shí)際細(xì)胞數(shù)量。丹參酮ⅡA干預(yù)的實(shí)驗(yàn)組瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的增殖活性受到不同程度的抑制，其中200ug/ml組抑制作用最為明顯，干預(yù)72小時(shí)、96小時(shí)、120小時(shí)后，OD值均數(shù)分別為0.41±0.10、0.60±0.27、0.70±0.27;而同期對(duì)照組0ug/ml組的OD值均數(shù)分別為0.56±0.02、0.97±0.01

16、、0.99±0.06，計(jì)算其增殖抑制率分別為100.00％、76.29％、71.72％。統(tǒng)計(jì)分析顯示，干預(yù)濃度對(duì)細(xì)胞活性的影響具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=781.91，P＜0.001)，干預(yù)時(shí)間對(duì)細(xì)胞活性的影響具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1068.62，P＜0.001)，干預(yù)濃度和干預(yù)時(shí)間的交互作用對(duì)細(xì)胞活性的影響也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=159.04，P＜0.001)。
　　 2.流式細(xì)胞術(shù)AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡顯示，丹

17、參酮ⅡA干預(yù)的實(shí)驗(yàn)組瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的早期凋亡率明顯增高，其中200ug/ml組早期凋亡率增高最為明顯，干預(yù)120小時(shí)后，早期凋亡率均數(shù)達(dá)41.62±1.84％，同期對(duì)照組0ug/ml組的早期凋亡率為3.68±0.76％，早期凋亡增加百分比達(dá)1030.98％。統(tǒng)計(jì)分析顯示干預(yù)濃度對(duì)早期凋亡率的影響具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=654.17，P＜0.001)，干預(yù)時(shí)間對(duì)早期凋亡率的影響具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=252.42，P＜0.001)，干預(yù)濃度和

18、干預(yù)時(shí)間的交互作用對(duì)早期凋亡率的影響也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=91.91，P＜0.001)。
　　 3.流式細(xì)胞術(shù)PI法DNA染色檢測(cè)細(xì)胞細(xì)胞周期顯示，丹參酮ⅡA干預(yù)的實(shí)驗(yàn)組瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的G0/G1期比例均不同程度增加，其中200ug/ml組G0/G1期比例增加最為明顯，干預(yù)120小時(shí)后，G0/G1期均值為94.16±1.10％，同期對(duì)照組0ug/ml組的G0/G1期比例均數(shù)為75.13±1.53％，計(jì)算G0/G1期增加百分比達(dá)

19、25.33％。統(tǒng)計(jì)分析顯示，干預(yù)濃度對(duì)G0/G1期比例的影響具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=60.31，P＜0.001)，干預(yù)時(shí)間對(duì)G0/G1期比例的影響具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=24.44，P＜0.001)，干預(yù)濃度和干預(yù)時(shí)間的交互作用對(duì)G0/G1期比例的影響也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=13.01，P＜0.001)。
　　 4.瘢痕疙瘩組織大體形念觀察發(fā)現(xiàn)，該動(dòng)物模型未見排斥反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組連續(xù)干預(yù)14天后，實(shí)驗(yàn)組瘢痕疙瘩組織塊大小為364.33±

20、50.17mm3，對(duì)照組瘢痕疙瘩組織塊大小為392.33±32.26mm3，兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析顯示，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組瘢痕疙瘩組織塊大小差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 5.HE染色及Masson三色法染色瘢痕疙瘩組織的組織形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，該動(dòng)物模型中瘢痕疙瘩組織塊移植后組織血供良好，無排斥反應(yīng)，并能夠基本保持原有的組織學(xué)形態(tài)和生物學(xué)形態(tài)。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組瘢痕疙瘩組織塊的HE染色及Masson三色法染色的組織形態(tài)學(xué)表現(xiàn)未發(fā)現(xiàn)明顯的差異。

21、
　　 6.Tunel法凋亡細(xì)胞染色發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組瘢痕疙瘩組織塊的表皮部位能見到少量的凋亡細(xì)胞，瘢痕疙瘩組織塊內(nèi)部則極少發(fā)現(xiàn)凋亡細(xì)胞;而實(shí)驗(yàn)組瘢痕疙瘩組織塊表皮及組織塊內(nèi)部均能可見大量凋亡細(xì)胞。
　　 五、結(jié)論
　　 丹參酮ⅡA可抑制體外培養(yǎng)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的增殖活性，誘導(dǎo)其凋亡，并阻滯細(xì)胞周期，且干預(yù)效果存在干預(yù)濃度依耐性及干預(yù)時(shí)間依耐性;保留表皮的瘢痕疙瘩組織塊植入裸鼠右側(cè)肩胛皮下的瘢痕疙瘩裸鼠模型，可以基本