丹參酮Ⅰ通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和自噬抑制腫瘤細(xì)胞增殖的體外研究.pdf

1、丹參是臨床常用的活血化瘀中藥，隨著活血化瘀治則在腫瘤治療中的廣泛應(yīng)用，丹參抗腫瘤作用的機(jī)制已成為現(xiàn)代中藥抗腫瘤藥理研究的熱點(diǎn)。丹參酮Ⅰ(T1)是從中藥植物丹參中提取出的脂溶性菲醌化合物，近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)T1具有抗炎、抗氧化和抗癌等作用。本課題組在前期研究丹參中的單體隱丹參酮（Cryptotanshinone，CPT）時(shí)發(fā)現(xiàn)T1可以抑制乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖，但是其抗腫瘤作用的分子機(jī)制仍不清楚。本研究選擇乳腺癌細(xì)胞系和肝癌細(xì)胞系為研究對(duì)象，

2、進(jìn)一步探討T1的抗腫瘤作用及其相關(guān)的分子機(jī)制。
　　目的:初步探討T1的抗腫瘤作用，以及T1抗腫瘤作用的分子機(jī)制，為丹參用于臨床治療腫瘤提供理論依據(jù)。
　　方法:本研究以乳腺癌MCF-7(ER+)、MDA-MB-231(ER-)和肝癌HepG2細(xì)胞系為研究對(duì)象。MTT法檢測(cè)藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用;光學(xué)顯微鏡下觀察T1處理后腫瘤細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)T1對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡和周期分布的影響;Western印跡雜交(W

3、estern blotting)檢測(cè)T1對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡蛋白、周期蛋白和自噬相關(guān)蛋白的影響以及T1分別與自噬抑制劑和AMPK抑制劑聯(lián)合使用對(duì)自噬通路相關(guān)蛋白的影響;吖啶橙染色檢測(cè)T1對(duì)腫瘤細(xì)胞自噬的影響以及透射電鏡下觀察自噬現(xiàn)象。
　　結(jié)果:
　　用0、2μM、4μM、6μM、8μM、10μM不同濃度的T1分別處理三種腫瘤細(xì)胞24h、48h和72h:對(duì)于乳腺癌MDA-MB-231和肝癌HepG2細(xì)胞，細(xì)胞平均存活率均在6μM的

4、T1處理24h顯著下降，分別為82.8％(p＜0.05)和63.9％(p＜0.05); T1對(duì)于MDA-MB-231細(xì)胞，24h、48h和72h的IC50分別是11.25μM、7.87μM和5.65μM; T1對(duì)于HepG2細(xì)胞，24h、48h和72h的IC50分別是7.75μM、7.03μM和6.44μM。而對(duì)于乳腺癌MCF-7細(xì)胞，2μM的T1處理24h細(xì)胞平均存活率為80.9％(p＜0.05)，24h、48h和72h的IC50分別

5、是10.63μM、3.72μM和3.15μM。表明T1處理上述三種腫瘤細(xì)胞24h能明顯抑制細(xì)胞增殖。
　　在光學(xué)顯微鏡下觀察，經(jīng)10μM T1處理24h和48h的HepG2、MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞，均發(fā)生透光性變差，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生皺縮或變圓脫落，漂浮于培養(yǎng)液中，貼壁細(xì)胞密度明顯降低，相比于不加T1的對(duì)照組(Control，CTR)，細(xì)胞死亡數(shù)增加。
　　10μM T1處理肝癌HepG2細(xì)胞48h，對(duì)照組平均早期凋

6、亡率為0.74％，平均晚期凋亡率為1.37％;10μMT1實(shí)驗(yàn)組，平均早期凋亡率為4.36％，平均晚期凋亡率為6.04％。10μM T1處理乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞48h，對(duì)照組平均早期凋亡率為1.87％，平均晚期凋亡率為12.29％;10μM T1實(shí)驗(yàn)組，平均早期凋亡率為5.08％，平均晚期凋亡率為27.63％。二者實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率明顯高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)，表明T1促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。
　　流式

7、細(xì)胞術(shù)檢測(cè)周期分布發(fā)現(xiàn)用10μM T1處理肝癌HepG2細(xì)胞48h，對(duì)照組處于G1、G2和S期的細(xì)胞平均百分率分別為64.15％、5.50％和30.36％;加入T1的實(shí)驗(yàn)組處于G1、G2和S期的細(xì)胞平均百分率分別為62.77％、6.95％和30.28％。10μMT1處理乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞48h，對(duì)照組處于G1、G2和S期的細(xì)胞平均百分率分別為46.42％、26.17％和27.42％;實(shí)驗(yàn)組處于G1、G2和S期的細(xì)胞平均百分率

8、分別為45.82％、25.57％和28.61％。兩種細(xì)胞的周期分布，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組沒(méi)有明顯差異(p＞0.05)，表明T1不影響腫瘤細(xì)胞周期分布。
　　Western blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)用10μM T1分別處理HepG2、MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞24h和48h，三種細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白C-parp(PARP89KD)的表達(dá)水平均明顯強(qiáng)于對(duì)照組，表明T1誘導(dǎo)上述三種細(xì)胞發(fā)生凋亡。
　　Western blottin

9、g檢測(cè)發(fā)現(xiàn)用10μM T1分別處理HepG2和MDA-MB-231細(xì)胞24h和48h，細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ的表達(dá)水平實(shí)驗(yàn)組明顯強(qiáng)于對(duì)照組，表明T1誘導(dǎo)HepG2和MDA-MB-231細(xì)胞發(fā)生自噬。
　　熒光顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞水平上的自噬，10μM T1分別處理HepG2、MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞24h和48h時(shí)，經(jīng)吖啶橙(AO)染色處理，與對(duì)照組相比，加入T1的實(shí)驗(yàn)組產(chǎn)生橙色熒光，表明T1誘導(dǎo)上述細(xì)胞發(fā)生自噬形成酸性

10、自噬泡。
　　透射電鏡下檢測(cè)自噬現(xiàn)象，10μM T1處理MDA-MB-231細(xì)胞48h，電鏡下觀察到自噬泡的形成，證明T1誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞發(fā)生自噬現(xiàn)象。
　　MTT法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)10μM T1與10μM的自噬抑制劑3-Methyladenine(3MA)聯(lián)合使用處理MDA-MB-231細(xì)胞48h，單獨(dú)使用T1組細(xì)胞平均存活率為36.2％，聯(lián)合用藥組(10μM T1+10μM3MA)的細(xì)胞平均存活率為48.9％，明顯高

11、于單獨(dú)使用T1的實(shí)驗(yàn)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。10μM T1與5μM的自噬抑制劑氯喹(Chloroquine，CQ)聯(lián)合使用處理MDA-MB-231細(xì)胞48h，單獨(dú)使用T1處理，細(xì)胞平均存活率為31.4％，聯(lián)合用藥組（10μMT1+5μM CQ）的細(xì)胞平均存活率為49.5％，明顯高于單獨(dú)使用T1的實(shí)驗(yàn)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。對(duì)于HepG2細(xì)胞，10μMT1與20μM的3MA聯(lián)合使用處理48h，單獨(dú)使用T1組

12、細(xì)胞平均存活率為29.3％，聯(lián)合用藥組（10μMT1+20μM3MA）的細(xì)胞平均存活率為35.4％，高于單獨(dú)使用T1的實(shí)驗(yàn)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。10μM T1與15μM的CQ聯(lián)合使用處理48h，單獨(dú)使用T1組細(xì)胞平均存活率為42.6％，聯(lián)合用藥組（10μM T1+15μM CQ）的細(xì)胞平均存活率為51.8％，高于單獨(dú)使用T1的實(shí)驗(yàn)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。結(jié)果表明T1與自噬抑制劑聯(lián)合使用能夠部分解除T1對(duì)

13、MDA-MB-231和HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用，表明T1誘導(dǎo)上述細(xì)胞發(fā)生了自噬性死亡。
　　Western blotting檢測(cè)10μMT1處理MDA-MB-231和HepG2細(xì)胞24h和48h發(fā)現(xiàn)，T1處理后p-AMPKα的表達(dá)水平明顯升高，表明T1能夠激活MDA-MB-231和HepG2細(xì)胞中AMPK通路。
　　Western blotting檢測(cè)10μM T1和20μM AMPK抑制劑Dorsomorphin2HC

14、1(DP)聯(lián)合使用后對(duì)HepG2細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)變化的影響，發(fā)現(xiàn)單獨(dú)使用T1處理12h和24h，Beclin1、LC3Ⅱ和p-AMPKα的表達(dá)水平同時(shí)增加;而T1與DP聯(lián)合使用后，與單獨(dú)使用T1相比，Beclin1、LC3Ⅱ和p-AMPKα的表達(dá)均接近不加藥的對(duì)照組的水平。表明T1誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞發(fā)生的自噬依賴(lài)于AMPK的激活。
　　結(jié)論:本研究結(jié)果表明T1對(duì)乳腺癌MDA-MB-231、MCF-7和肝癌HepG2細(xì)胞系的增殖