殼寡糖誘導Hela、A549細胞凋亡和自噬的研究.pdf

1、癌癥嚴重威脅人類健康，它的治療仍是醫(yī)學界的一大難題，因此，尋找一種新型抗腫瘤藥物具有重要意義。
　　殼寡糖（COS）具有很好的抗腫瘤活性，且無毒副作用，是抗腫瘤藥物的理想候選材料。不同聚合度的COS對腫瘤細胞的影響不同。為了明確COS對腫瘤細胞增殖的影響，本研究利用金屬配位控制氧化降解殼聚糖的方法制備COS，采用不同濃度的殼寡糖分別處理Hela細胞、A549細胞12h和24h，MTT法檢測表明，隨著COS濃度升高、作用時間延長，對

2、細胞增殖的抑制作用逐漸增強，呈時間劑量依賴關系(P<0.01)，當濃度為5.0mg·mL-1時對兩株細胞增殖的抑制率分別達到了52.15%和57.63%。推測COS對細胞增殖的抑制作用可能是通過誘導細胞凋亡或自噬發(fā)生的。
　　為了分析COS對細胞凋亡的影響，本研究采用Wright's-Giemsa染色法和AO-EB染色法觀察COS處理Hela細胞、A549細胞后細胞的形態(tài)學變化，流式細胞儀定量檢測COS處理后細胞凋亡情況，利用免疫

3、組化法分析凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2和Survivin的表達。結果表明，Wright’s-Giemsa染色后Hela細胞和A549細胞的細胞膜褶皺，細胞核固縮，并出現(xiàn)凋亡小體。熒光顯微鏡下觀察COS處理、AO-EB染色的Hela細胞、A549細胞，細胞固縮的橘紅色凋亡細胞增多。AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測凋亡細胞發(fā)現(xiàn)，COS處理Hela細胞24h時凋亡率為31.8%，處理A549細胞24h時凋亡率為37.8%。免疫組化

4、分析表明，COS能夠上調促凋亡蛋白Bax的表達，下調抑制凋亡蛋白Bcl-2和Survivin的表達。這些結果表明，COS對細胞增殖的抑制作用與誘導細胞凋亡相關。
　　COS是否誘導細胞自噬活性增強？本文利用COS處理Hela細胞、A549細胞后，應用MDC熒光染色、LC3免疫熒光染色法、以及Western-blot法檢測COS分別處理細胞4h、8h、12h后細胞內LC3Ⅰ和LC3Ⅱ蛋白表達的情況。結果表明，處理后的Hela細胞、A

5、549細胞MDC染色后細胞核周區(qū)域熒光強度增加，推測可能是細胞內自噬泡數(shù)或自噬體數(shù)增多。免疫熒光染色法觀察COS處理后的細胞質內均出現(xiàn)亮點狀熒光顆粒，表明細胞內LC3的表達量增加，且自噬體數(shù)量增多。Western-blot法檢測COS處理Hela細胞和A549細胞4h時LC3Ⅰ的表達量明顯多于LC3Ⅱ；處理8h時，LC3Ⅰ量減少，而LC3Ⅱ量增加；處理12h時，可以明顯觀察到LC3Ⅰ絕大部分轉變?yōu)長C3Ⅱ。這個結果表明，隨著COS處理時