姜黃素類似物EF24對A549細(xì)胞自噬及凋亡的影響及其毒理學(xué)研究.pdf

1、姜黃素(Curcumin)是一種傳統(tǒng)的中藥，在體內(nèi)、體外具有很多的藥理學(xué)活性，包括抗炎、抗氧化、抗衰老、抗病毒、抗腫瘤等，而且在細(xì)胞內(nèi)作用的分子靶點很多。通過姜黃素的研究表明生物體的利用效率比較低，也難溶于水，容易被氧化的特點，因此為了更好的提高其抗腫瘤等其他的生物藥理學(xué)活性，通過以姜黃素為母體進行適當(dāng)?shù)母脑煲呀?jīng)成為一種新型抗腫瘤藥物開發(fā)的方向之一。
　　 聯(lián)苯二氟酮EF24[3，5-bis(2-flurobenzylidene

2、)piperdin-4-one]為姜黃素的改造物。目前研究EF24主要集中在抗腫瘤促進細(xì)胞凋亡及其發(fā)現(xiàn)抗腫瘤的分子靶點上，但是未發(fā)現(xiàn)EF24能夠引起腫瘤細(xì)胞自噬的報道。
　　 我們研究的目的是從自噬和凋亡的角度進行分析姜黃素類似物EF24對腫瘤細(xì)胞A549(人肺腺癌細(xì)胞)的殺傷機理，同時選用正常細(xì)胞HEK293，秀麗隱桿線蟲作為從細(xì)胞及個體水平初步評價其毒副作用。我們選用不同濃度的EF24處理A549細(xì)胞12h、24h、48h后

3、，通過MTT的實驗檢測細(xì)胞的存活率，PI染色、GFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、吖啶橙染色、蛋白質(zhì)檢測凋亡、自噬及AMPK-mTOR-S6K信號通路的變化。以正常細(xì)胞HEK293在細(xì)胞水平及秀麗隱桿線蟲個體水平，采用細(xì)胞抑制率實驗及與秀麗桿線蟲運動相關(guān)的指標(biāo)(頭部擺動頻率、身體彎曲頻率)、體長、生殖相關(guān)指標(biāo)(后代數(shù)目、世代時間)來初步評價EF24的毒副作用。
　　 研究結(jié)果顯示：EF24能夠抑制A549細(xì)胞的生長，其抑制效果要優(yōu)于姜黃素，

4、并且其抑制效果呈現(xiàn)劑量與時間依賴關(guān)系。EF24處理A549細(xì)胞24h時，自噬及凋亡檢測顯示在低濃度(4μmol/L、8μmol/L)的條件下，細(xì)胞能夠產(chǎn)生自噬，并以自噬現(xiàn)象為主；在高濃度條件下(16μmol/L)細(xì)胞以凋亡為主。EF24能夠使A549細(xì)胞阻抑在G2/M期，從而達到抑制腫瘤細(xì)胞生長。并且通過加入自噬性抑制劑渥曼青霉素后，通過對吖啶橙染色、凋亡蛋白caspase-3、自噬標(biāo)志性蛋白LC3的檢測和細(xì)胞生存率顯示自噬對細(xì)胞凋亡過

5、程中起到促進作用。在通路蛋白的檢測發(fā)現(xiàn)，隨著EF24濃度的增加，AMPK磷酸化水平升高、mTOR、S6K磷酸化水平降低。可能是通過AMPK-mTOR-S6K途徑來抑制A549細(xì)胞的生長。
　　 在正常細(xì)胞HEK293中顯示，EF24的毒副作用要大于姜黃素，并且小于順鉑。并且隨著EF24濃度的加大，HEK293的存活率逐漸降低，其殺傷正常細(xì)胞的能力大于姜黃素而小于順鉑。在線蟲試驗中發(fā)現(xiàn)，在低于64μmol/L濃度條件下，未產(chǎn)生毒副