姜黃素類似物B6對腫瘤細胞抑制作用及類似物WZ35緩解DN損傷研究.pdf

1、第一部分以成纖維細胞生長因子受體1為靶點的姜黃素類似物的抗腫瘤活性研究
　　目的：
　　1，根據(jù)前期的實驗結(jié)果，合成并篩選出EF24類似物B6。
　　2，檢測EF24與B6兩種化合物對多種腫瘤細胞增殖的影響，揭示B6的抗腫瘤活性。
　　3，通過B6對腫瘤細胞NCI-H460細胞bFGF/FGFR下游信號蛋白表達的檢測，了解B6促細胞凋亡的靶點及機制。
　　4，探討EF24與B6在抗腫瘤藥物開發(fā)過程中的作用及

2、臨床應用價值。
　　方法：
　　1，通過改造單羰基姜黃素類似物3，5-雙（2-氟苯亞甲基）哌啶-4-酮(EF24)，合成了其類似物[3,5-雙（2-溴苯亞甲基）哌啶-4-酮，B6];
　　2，采用FGFR1酪氨酸激酶實驗驗證其靶向性;
　　3，MTT法檢測EF24和B6對正常人肝細胞HL7702、4種腫瘤細胞（人大細胞肺癌NCI-H460、人胃癌細胞SGC-7901、人小細胞肺癌A549、人星形膠質(zhì)瘤細胞株U25

3、1)增殖的影響;
　　4，WB法檢測B6(2.5、5、10umol/L)對NCI-H460細胞bFGF/FGFR下游信號蛋白表達的影響;
　　5，Caspase-3試劑盒檢測Caspase-3因子的表達。
　　結(jié)果：
　　1，根據(jù)EF24與B6對FGFR1酪氨酸激酶的活性分析，結(jié)果顯示溴取代的EF24類似物B6表現(xiàn)出很好的抑制活性，相較于先導物EF24抑制效果有明顯的提高和改善。
　　2，根據(jù)對多種腫瘤細胞

4、的增殖活性抑制分析，結(jié)果顯示EF24及其類似物B6對4種腫瘤細胞的半數(shù)抑制率均達到微摩爾級別，但是對正常肝細胞HL7702細胞抑制作用EF24類似物B6較差，表現(xiàn)出較弱的細胞毒性作用，相對EF24有較高的安全性。我們還能發(fā)現(xiàn)類似物B6對NCI-H460的IC50值相對其他腫瘤細胞要低很多，顯示類似物B6對NCI-H460的增殖抑制具有很好的細胞選擇性。
　　3，為了進一步探索EF24類似物B6對FGFR1的作用機制，因此在腫瘤細胞

5、NCI-H460中檢測其對FGFR1活化的影響，采用WB技術(shù)檢測，結(jié)果顯示活性類似物B6對NCI-H460中FGFR1及其下游信號分子AKT及ERK1/2活化有明顯抑制作用，并且抑制效果較先導化合物EF24好。且隨著化合物濃度的增加(2.5，5，10μM)，對FGFR1及其下游信號分子AKT及ERK1/2活化的抑制作用逐漸增強，表現(xiàn)出很好的劑量依賴性。
　　4，比較EF24及其類似物B6對NCI-H460細胞的促凋亡作用，5uM

6、B6作用于NCI-H460細胞12h后能有效地誘導caspase3和9的表達，且強于先導化合物EF24?；衔顴F24以及類似物B6作用于細胞后，凋亡蛋白caspase3酶的活性相對陰性對照組有明顯增強。
　　結(jié)論：
　　1，EF24類似物B6有效地抑制了多種腫瘤細胞的增殖，并對NCI-H460有較好的選擇性，且具有較高的安全性。
　　2，細胞內(nèi)信號分子檢測發(fā)現(xiàn)EF24類似物B6對bFGF/FGFR信號通路中FGFR1

7、以及下游信號蛋白AKT和ERK1/2的活化具有很強的抑制作用，并呈現(xiàn)出良好的劑量依賴性，因此表明該類似物B6不僅可以抑制FGFR1激酶的活性，同時還可以抑制bFGF/FGFR信號通路中FGFR1以及下游的信號蛋白AKT和ERK1/2的活化，說明了類似物B6確實是FGFR1的抑制劑。
　　3，Western Blot實驗結(jié)果進一步表明B6能有效地誘導caspase3和caspase9的表達，同時Caspase3試劑盒的檢測結(jié)果也進一

8、步驗證了這一點。
　　4，通過先導物EF24設(shè)計改構(gòu)獲得的類似物B6體外對多種腫瘤細胞有增殖抑制作用，尤其是對NCI-H460細胞;
　　5，對FGFR1激酶有很好的抑制活性，也能明顯抑制了FGFR1及下游增殖信號蛋白AKT及ERK1/2的活化，促進腫瘤細胞的凋亡，其效果較先導化合物有明顯提高和改善，并具有更好的安全性。
　　6，通過細胞實驗證明了以EF24為先導化合物合成靶向FGFR1的小分子抑制劑的思路是可行的，并

9、具有很好的研發(fā)前景。
　　第二部分姜黃素類似物抑制炎癥反應緩解Ⅰ型糖尿病腎損傷實驗研究
　　目的：
　　(1)實驗驗證單羰基姜黃素類似物WZ35的抗炎活性;
　　(2)通過建立Ⅰ型糖尿病模型，觀察WZ35對糖尿病腎病的緩解作用;
　　(3)檢測并觀察WZ35對血清和腎臟組織中的炎癥因子和趨化因子表達的影響;
　　(4)初步探討姜黃素類似物WZ35治療糖尿病腎病(DN)的分子機制，為DN的治療提供候選藥

10、物。
　　方法：
　　(1)采用ip鏈脲佐霉素(STZ)的方法制備Ⅰ型糖尿病小鼠模型;
　　(2)連續(xù)給藥，每周測定各組小鼠的體重和血糖;
　　(3)實驗結(jié)束時生化分析儀檢測血清中肌酐(Cr)和尿素氮(BUN)水平;
　　(4) HE染色觀察腎組織病理性損傷情況;
　　(5)采用RT-qPCR檢測腎臟組織中炎癥因子和趨化因子的表達;
　　(6) CD68免疫組化染色檢測腎臟組織巨噬細胞浸潤情況。

11、
　　結(jié)果：
　　(1)與對照組相比，模型組小鼠體重下降，血糖升高，腎臟指數(shù)增加，血清中Cr和BUN水平升高，腎臟病理性損傷明顯，腎臟組織中炎癥因子和趨化因子表達明顯增加，腎臟組織巨噬細胞浸潤增加;
　　(2)姜黃素及其類似物WZ35對模型小鼠質(zhì)量、血糖和腎臟指數(shù)無明顯影響;
　　(3)姜黃素及其類似物WZ35能顯著降低模型小鼠血清中Cr和BUN的水平;
　　(4)姜黃素及其類似物WZ35能明顯緩解Ⅰ型糖尿

12、病引起的腎組織損傷;
　　(5) WZ35較姜黃素抑制腎臟組織中的炎癥因子和趨化因子的基因表達及巨噬細胞浸潤強。
　　結(jié)論：
　　(1)姜黃素極其類似物WZ35不能明顯改善糖尿病引起的體重下降和血糖升高，但對于腎臟的損傷起到了明顯的緩解作用;
　　(2)姜黃素類似物WZ35不是通過降糖作用緩解糖尿病腎病;
　　(3)姜黃素類似物能夠通過抑制炎癥反應緩解糖尿病腎病。
　　(4)對姜黃素和其類似物WZ35