單羰基姜黃素類似物抗腫瘤活性篩選及作用機制研究.pdf

1、目的：
　　 1．本實驗室對姜黃素進行結(jié)構(gòu)改造，合成了大量單羰基姜黃素類似物。本文運用MTT的方法對合成的158種類似物（附錄1）進行初篩以期得到一批具有較好活性的化合物。
　　 2．研究初篩得到的活性化合物對5種不同腫瘤細(xì)胞增殖的影響，研究其抗腫瘤譜，并做量效關(guān)系研究。
　　 3．研究活性化合物對GADD153/CHOP蛋白表達的影響。
　　 4．研究活性化合物在mRNA水平上對GADD153/CHOP

2、，XBP-1，GRP-78，ATF-4的影響。
　　 5．研究活性化合物對細(xì)胞凋亡的影響，探討其抗腫瘤活性發(fā)揮作用的分子機制。
　　 方法：
　　 1．姜黃素在臨床應(yīng)用中存在代謝過快、半衰期短、血藥濃度低、生物利用度低等藥代缺陷，研究表明，其結(jié)構(gòu)中含有的β-二酮基團是導(dǎo)致其代謝缺陷的主要原因，因此，我們?nèi)サ籀?二酮基團，設(shè)計不含有β-二酮基團的單羰基類似物。
　　 2．抗腫瘤活性篩選體外培養(yǎng)HepG2，H

3、460，MCF-7，A549，A549/CDDP細(xì)胞，采用MTT法檢測受測化合物對上述五種細(xì)胞的增殖抑制作用。
　　 3．量效關(guān)系研究根據(jù)上述MTT的結(jié)果，選取活性較好的7個化合物，用MTT法研究其抗腫瘤細(xì)胞增殖作用的量效關(guān)系。
　　 4．檢測GADD153/CHOP蛋白表達情況Westernblot法檢測上述5種細(xì)胞在活性較好的7個化合物作用下GADD153/CHOP蛋白表達情況。
　　 5．檢測凋亡情況根據(jù)W

4、esternblot實驗結(jié)果，選取化合物31，用AnnexinV/PI染色，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡的情況。
　　 6．檢測ERS信號通路中的轉(zhuǎn)錄因子用Q-PCR的方法，檢測細(xì)胞株H460在化合物31作用后GADD153/CHOP，XBP-1，GRP-78，ATF-4的mRNA的變化。
　　 結(jié)果：
　　 1．MTT結(jié)果顯示部分受測姜黃素類似物可抑制上述5種腫瘤細(xì)胞，并具劑量依賴性，在濃度為20μM時，對細(xì)胞生長的

5、抑制作用明顯增強。
　　 2．Westernblot分析顯示，上述5種細(xì)胞在7個姜黃素類似物作用下，有的表達GADD153/CHOP，有的不表達GADD153/CHOP。GADD153/CHOP蛋白是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路中的關(guān)鍵蛋白，對于有表達GADD153/CHOP的化合物，其抗腫瘤作用可能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)，其他化合物則可能通過其他途徑發(fā)揮抗腫瘤作用。
　　 3．流式細(xì)胞檢測顯示，與陰性對照DMSO相比，化合物31可明顯

6、誘導(dǎo)H460細(xì)胞凋亡。證實化合物31抗腫瘤活性發(fā)揮作用是通過凋亡途徑進行的。
　　 4．QPCR結(jié)果顯示，在化合物31作用下，GADD153/CHOP，XBP-1，GRP-78，ATF-4的mRNA的表達增強，并呈現(xiàn)濃度依賴性，表明其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的途徑與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)。
　　 結(jié)論：
　　 1．通過MTT實驗，發(fā)現(xiàn)所合成的單羰基姜黃素類似物中，有一些活性較好,可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，并且活性較好的7個化合物具有劑

7、量依賴性。
　　 2．通過檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmicreticulumstress，ERS）相關(guān)凋亡通路上的重要分子CHOP/GADD153相應(yīng)蛋白表達的變化，推斷其抗腫瘤活性的分子機制。
　　 3．通過QPCR的方法檢測與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）及凋亡相關(guān)分子CHOP/GADD153，XBP-1，GRP78，ATF-4mRNA的變化，進一步推斷其抗腫瘤活性的分子機制。
　　 4．通過AnnexinV/P