NOX1對(duì)A549細(xì)胞增殖及凋亡的影響.pdf

1、背景:
　　肺癌是目前中國(guó)死亡率最高的癌癥。抽煙、環(huán)境污染的加劇等均是加大患肺癌風(fēng)險(xiǎn)的危險(xiǎn)因素。而活性氧（reactive oxygen species, ROS）在上述條件下表達(dá)量均上升。NADPH氧化酶NOX（non-phagocyticcelloxidase, NOX）是非吞噬細(xì)胞中產(chǎn)生ROS的主要來(lái)源，生理情況下其產(chǎn)生的活性氧作為第二信使傳遞細(xì)胞內(nèi)的各種信號(hào)通路，但在外界各種因素如腫瘤壞死因子(Tumor necrosis

2、 factor, TNF-α)、脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）等的刺激下表達(dá)量升高，產(chǎn)生大量活性氧，對(duì)細(xì)胞和機(jī)體造成一系列的影響。目前有研究表明NOX1在許多腫瘤細(xì)胞系中表達(dá)量相對(duì)升高，這其中包括非小細(xì)胞肺癌。c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）又稱(chēng)為應(yīng)激活化蛋白激酶（stress-activated protein kinase, SAPK）,當(dāng)受到外界的刺激后，J

3、NK被磷酸化激活從而參與細(xì)胞凋亡信號(hào)通路。研究證實(shí)，NOX1產(chǎn)生的ROS能夠調(diào)節(jié)JNK的活化水平。因此研究NOX1在肺腺癌A549細(xì)胞增值與凋亡中發(fā)揮的作用顯得尤為重要。
　　實(shí)驗(yàn)首先通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)轉(zhuǎn)染特異性的 NOX1小干擾 RNA（ Small interference RNA，siRNA）抑制A549細(xì)胞中NOX1的表達(dá)，觀察細(xì)胞ROS水平的改變及增殖活性和凋亡率的變化，再采用TNF-α刺激A549細(xì)胞，檢測(cè)不同組別細(xì)胞凋

4、亡率的改變，以及NOX1、p-JNK和相應(yīng)的ROS的表達(dá)量的改變。通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)來(lái)研究 NOX1在 A549細(xì)胞增殖與凋亡中發(fā)揮的作用，從而為NOX1在肺癌中的的作用提供理論依據(jù)。
　　方法:
　　1實(shí)驗(yàn)方法
　　1.1分別設(shè)置Mock組、NC組和NOX1siRNA組，觀察抑制NOX1表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞增殖和凋亡的影響。采用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR檢測(cè)不同組別NOX1mRNA的表達(dá)量。為檢測(cè)TNF-α刺激A549細(xì)胞后NOX

5、1表達(dá)量的改變，設(shè)置空白對(duì)照組、TNF-α組和TNF-α+NOX1siRNA組。
　　1.2細(xì)胞增殖活性檢測(cè)：轉(zhuǎn)染12 h后對(duì)Mock組、NC組和實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)，自轉(zhuǎn)染后12 h開(kāi)始直至48 h之內(nèi)，每隔12h分別檢測(cè)不同組別在492nm處的光密度值。
　　1.3細(xì)胞活性氧的測(cè)定：轉(zhuǎn)染24h后對(duì)不同組別采用DCFH-DA標(biāo)記后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其熒光值。
　　1.4細(xì)胞相應(yīng)蛋白表達(dá)量的檢測(cè)：轉(zhuǎn)染NOX1siRNA至

6、細(xì)胞48 h以后，提取不同組別細(xì)胞的蛋白進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)，內(nèi)參蛋白為β-actin，所得結(jié)果采用Quantity One軟件分析不同組別蛋白相對(duì)表達(dá)量。
　　1.5細(xì)胞凋亡率的檢測(cè)：抑制NOX1表達(dá)的48 h后，消化不同組別的細(xì)胞并吹打混勻成單細(xì)胞懸液， Annexin-V-FITC、PI雙染法處理細(xì)胞懸液，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)不同組比細(xì)胞的凋亡率。
　　2統(tǒng)計(jì)方法：采用SPSS21.0對(duì)不同組別數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)

7、分析，采用單因素方差分析比較三組的均數(shù)之間的差異，兩兩比較采用LSD法或Dunnett法。檢驗(yàn)水準(zhǔn)取α=0.05。
　　結(jié)果:
　　1.轉(zhuǎn)染 NOX1siRNA對(duì)NOX1在A549細(xì)中表達(dá)的干擾效果：NOX1mRNA表達(dá)量與Mock組相比下降了約78％；NOX1蛋白的表達(dá)量與Mock組相比下降了約70%。
　　2.抑制 NOX1表達(dá)對(duì) A549細(xì)胞增殖活性的影響：與 Mock組相比較， NOX1siRNA組細(xì)胞在24

8、h、36 h和48 h的增殖活性均下降（P＜0.05）。
　　3.ROS表達(dá)量的改變：與Mock組相比，NOX1siRNA組的ROS水平下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與空白對(duì)照組相比較，TNF-α組的 ROS水平升高；與TNF-α組相比，TNF-α組+NOX1siRNA組的ROS水平下降；與空白對(duì)照組相比，TNF-α組+siRNA組的ROS水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　4.Western bl

9、ot：NOX1組的p-JNK表達(dá)量與Mock組和NC組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與空白對(duì)照組相比，TNF-α組的NOX1與p-JNK表達(dá)量均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與TNF-α相比，TNF-α組+NOX1siRNA組的NOX1與p-JNK表達(dá)量均下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　5.抑制NOX1表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞凋亡率的影響：NOX1siRNA組細(xì)胞早期凋亡率與NC組和Mock組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)