蛇床子素對(duì)肺癌A549細(xì)胞系增殖、凋亡、侵襲的影響及其機(jī)制的研究.pdf

1、前言：肺癌在世界范圍內(nèi)是癌癥死亡的首要病因,其中非小細(xì)胞肺癌占所有肺癌病例的80％。盡管臨床上對(duì)于肺癌的診斷及治療的技術(shù)不斷發(fā)展,但是許多國(guó)家肺癌的5年生存率仍低于15％。為了進(jìn)一步提高肺癌的生存率,人們希望找到療效好且不良反應(yīng)低的治療肺癌的藥物。近年來(lái)從中藥中提取的天然化合物因其廣泛的生物活性、低毒性和較少的副作用而備受關(guān)注。
　　 蛇床子素,7-甲氧基-8-異戊烯基香豆素,是蛇床子中活性成分,蛇床子素可以從許多藥用植物中提取

2、,如蛇床子及其他植物。在我國(guó)的傳統(tǒng)中醫(yī)中,蛇床子素長(zhǎng)期以來(lái)被用于治療濕疹,皮膚搔癢,陰道滴蟲(chóng)感染及性功能障礙等。最近的研究表明蛇床子素可能具有抑制增殖,擴(kuò)張血管,抗炎,抗微生物,抗過(guò)敏及預(yù)防肝炎等作用。此外,蛇床子素的抗腫瘤作用已經(jīng)有所報(bào)道。這些研究表明,蛇床子素能抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移。然而,蛇床子素對(duì)人類(lèi)肺癌細(xì)胞的影響及機(jī)制目前仍不清楚。
　　 本研究探討天然化合物蛇床子素(Osthole)對(duì)肺癌的抗腫瘤作用,對(duì)蛇床子

3、素對(duì)肺癌A549細(xì)胞系增殖、周期、凋亡、侵襲的影響及機(jī)制進(jìn)行初步探討。為深入研究蛇床子素抗腫瘤機(jī)制提供試驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 材料與方法：
　　 一、蛇床子素對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖、周期的影響的研究
　　 1、采用四甲基偶氮噻藍(lán)(MTT)法檢測(cè)蛇床子素對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響;
　　 2、流式細(xì)胞儀檢測(cè)蛇床子素對(duì)A549細(xì)胞細(xì)胞周期的影響;
　　 3、western blotting檢測(cè)蛇床子素作用于A

4、549細(xì)胞后Cyclin蛋白家族、CDC2等相關(guān)蛋白表達(dá)。
　　 二、蛇床子素對(duì)肺癌A549細(xì)胞凋亡的影響的研究
　　 1、采用流式細(xì)胞儀AnnexinV/PI雙染法檢測(cè)蛇床子素作用于A549細(xì)胞后細(xì)胞凋亡情況;
　　 2、熒光顯微鏡觀察蛇床子素作用于A549細(xì)胞后細(xì)胞形態(tài)變化;
　　 3、western blotting檢測(cè)蛇床子素作用于A549細(xì)胞后Bcl-2、Bax等凋亡相關(guān)蛋白表達(dá);
　　

5、 4、western blotting檢測(cè)蛇床子素作用于A549細(xì)胞后Akt及p-Akt表達(dá)。
　　 三、蛇床子素對(duì)肺癌A549細(xì)胞侵襲、遷移的影響的研究
　　 1、Transwell小室分析蛇床子素對(duì)肺癌A549細(xì)胞侵襲的影響;
　　 2、Transwell小室分析蛇床子素對(duì)肺癌A549細(xì)胞遷移的影響;
　　 3、western blotting檢測(cè)蛇床子素作用于A549細(xì)胞后MMP-2、MMP-9侵襲

6、相關(guān)蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 一、蛇床子素對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖、周期的影響
　　 1、MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示隨著濃度的加大和作用時(shí)間的延長(zhǎng),藥物對(duì)細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用,呈現(xiàn)明顯的時(shí)間一劑量效應(yīng)關(guān)系。
　　 2、流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期檢測(cè),蛇床子素對(duì)A549有周期阻滯作用,阻滯于G2/M期。
　　 3、采用western blotting方法檢測(cè)蛇床子素對(duì)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白,隨藥物濃度增加

7、,Cyclin B1及CDC2表達(dá)較少,并具有劑量依賴(lài)性。
　　 二、蛇床子素對(duì)肺癌A549細(xì)胞凋亡影響的研究
　　 1、采用流式細(xì)胞儀AnnexinV/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡;流式細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞凋亡分析表明作用隨濃度的增高,早期凋亡和晚期凋亡細(xì)胞的比例都逐漸增加,與對(duì)照組相比差異具有顯著性。
　　 2、熒光電子顯微鏡觀察藥物作用后的細(xì)胞中可見(jiàn)染色體邊集、核碎裂等典型的凋亡改變,而對(duì)照組沒(méi)有相應(yīng)的變化。
　　

8、 3、采用western blotting方法檢測(cè)蛇床子素對(duì)凋亡相關(guān)的蛋白如Bcl-2、Bax的表達(dá)的影響。隨藥物濃度增加,Bax蛋白表達(dá)水平逐漸升高,而B(niǎo)cl-2蛋白表達(dá)水平隨濃度的增加逐漸降低,Bax/Bcl-2的比值逐漸升高,并呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性。
　　 4、蛇床子素作用后,采用western blotting方法檢測(cè)p-Akt逐漸降低,總Akt未見(jiàn)明顯變化。
　　 三、蛇床子素對(duì)肺癌A549細(xì)胞侵襲、遷移的影響的研

9、究
　　 1、應(yīng)用Transwell小室檢測(cè)蛇床子素對(duì)肺癌A549細(xì)胞侵襲、遷移能力的影響,發(fā)現(xiàn)蛇床子素處理后實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的侵襲、遷移能力有明顯降低。
　　 2、采用western blotting方法檢測(cè)MMP-2、MMP-9侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)。隨藥物濃度的增加,MMP-2、MMP-9表達(dá)減少,并具有劑量依賴(lài)性。
　　 結(jié)論：
　　 1、蛇床子素可以抑制肺癌A549細(xì)胞的增殖,這種抑制作用具有時(shí)間和濃度依賴(lài)