PUMA基因轉(zhuǎn)染對人肺癌A549細(xì)胞的促凋亡作用及其機制研究.pdf

1、腫瘤是當(dāng)今危害人類健康最嚴(yán)重的疾病之一。p53上調(diào)凋亡調(diào)控因子(p53up-regulated modulator of apoptosis，PUMA)是Bcl-2蛋白家族的促凋亡成員之一，具有強大的促凋亡作用。研究發(fā)現(xiàn)PUMA表達(dá)水平降低與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，上調(diào)腫瘤細(xì)胞中PUMA的表達(dá)可以增強腫瘤細(xì)胞對放化療的敏感性，說明PUMA是一個非常有前景的腫瘤基因治療靶點。
　　目的:
　　體外觀察PUMA基因轉(zhuǎn)染對人非小細(xì)胞肺

2、癌細(xì)胞A549的增殖、凋亡等生物學(xué)行為的影響，并探討其可能的分子機制及與DDP誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡之間的關(guān)系;觀察PUMA基因?qū)Ψ伟┘?xì)胞A549裸鼠移植瘤體內(nèi)基因治療的效果，旨在為臨床上肺癌的治療提供實驗依據(jù)。
　　方法:
　　余健教授惠贈的人野生型PUMA基因過表達(dá)質(zhì)粒pCEP4-(HA)2-PUMA由Invitrogen公司測序鑒定和GenBank上PUMA（登陸號:NM014417）基因序列一致，應(yīng)用Primer Premi

3、er5.0軟件分析并設(shè)計PCR引物，引物合成由Invitrogen有限公司完成。pCEP4-(HA)2-PUMA轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5a及其搖菌、質(zhì)粒的提取純化。
　　應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)、Polyfectine體外DNA轉(zhuǎn)染試劑介導(dǎo)真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549。實驗分組為:①Control組（只加入轉(zhuǎn)染試劑）;②空載體組(轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒pCEP4-(HA)2-C1);0PUMA組(轉(zhuǎn)染pCEP4-(HA)2-PUMA質(zhì)粒）;

4、④DDP組（用10μg/ml順鉑干預(yù)）;⑤PUMA+DDP組(轉(zhuǎn)染pCEP4-(HA)2-PUMA質(zhì)粒，并用10μg/ml順鉑干預(yù)）。MTT法檢測細(xì)胞增殖抑制率，Hoechst33342染色觀察細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測腫瘤細(xì)胞凋亡率的改變，RT-qPCR和Western blot方法檢測PUMA及凋亡相關(guān)基因Bax，Bcl-2的mRNA及蛋白表達(dá)水平的變化;初步探討PUMA基因在體外抑制A549細(xì)胞的分子機制。
　

5、　以BALB/C裸鼠為研究對象，取處于對數(shù)生長期的A549細(xì)胞，接種于裸鼠左右背皮下形成裸鼠移植瘤，將裸鼠隨機分成生理鹽水組、空載體組、DDP組、PUMA組和聯(lián)合治療組等5組。從接種形成直徑約為2～3 mm的瘤塊后在腫瘤及腫瘤周圍多點或腹腔注射治療，每隔72h給藥1次，共7次。每隔72h測量瘤塊直徑并計算腫瘤體積，繪制生長曲線。第27天處死裸鼠，拍照，稱重，計算腫瘤抑瘤率，觀察PUMA基因及其與DDP聯(lián)合應(yīng)用對裸鼠移植瘤的治療作用。應(yīng)用

6、免疫組織化學(xué)分析腫瘤PUMA，Bax，Bcl-2蛋白表達(dá)，探討PUMA基因在體內(nèi)抑制腫瘤生長的機制。
　　結(jié)果:
　　1、用Polyfectine體外DNA轉(zhuǎn)染試劑介導(dǎo)真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染肺癌細(xì)胞A549。MTT結(jié)果顯示:PUMA+DDP組的細(xì)胞生長抑制率明顯高于其他各組細(xì)胞，即各組的細(xì)胞生長抑制率呈現(xiàn)從一組到五組逐漸升高的趨勢，且抑制率隨處理時間的增加而有升高的趨勢。Hoeehst33342染色發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染PUMA基因及DDP處

7、理后，A549的細(xì)胞核均出現(xiàn)不同程度的致密濃染或碎塊狀的細(xì)胞凋亡形態(tài)。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果發(fā)現(xiàn):與Control和空載體組相比，PUMA組，DDP組PUMA+DDP組的凋亡率逐漸明顯升高（P＜0.05），而Control和空載體組的細(xì)胞凋亡率無明顯差異，PUMA+DDP組的細(xì)胞凋亡率明顯高于其他各組細(xì)胞(P＜0.05)。細(xì)胞凋亡情況與Hoechst33342染色情況相似。RT-qPCR及Westernblot結(jié)果顯示:PUMA+DDP，DDP

8、，PUMA組細(xì)胞的PUMA,Bax mRNA、蛋白表達(dá)水平都顯著升高(P＜0.05)，而PUMA+DDP，DDP，PUMA組細(xì)胞的Bcl-2mRNA、蛋白表達(dá)水平均下降(P＜0.05)。而Control和空載體組的PUMA，Bax，Bcl-2 mRNA蛋白表達(dá)水平無明顯差異。
　　2、PUMA基因治療裸鼠移植瘤實驗中，應(yīng)用PUMA基因、DDP和PUMA基因聯(lián)合DDP的3種治療方法的平均抑瘤率分別為(43.25±1.86)％，(55

9、.56±3.88)％和(77.59±1.24)％，與陰性對照組相比具有顯著差異(P＜0.01)。各治療組的平均瘤塊體積和重量與Control和陰性對照組相比均具有顯著差異(P＜0.01)，并且聯(lián)合治療組的抑制率明顯高于單純用DDP或PUMA基因的抑制率。免疫組織化學(xué)分析治療各組的移植瘤PUMA，Bax及Bcl-2蛋白表達(dá)顯示，隨著腫瘤抑制率的升高，PUMA，Bax蛋白的胞漿陽性升高，Bcl-2蛋白的胞漿陽性降低與Control和陰性對照

10、組相比均具有顯著差異（P＜0.01）。
　　結(jié)論:
　　1、PUMA基因轉(zhuǎn)染抑制肺癌細(xì)胞A549增殖，并促進(jìn)其凋亡。與DDP聯(lián)用時，比單純轉(zhuǎn)染PUMA基因或DDP干預(yù)相比，抑制效果更好，細(xì)胞凋亡率更高。
　　2、PUMA基因轉(zhuǎn)染提高了細(xì)胞中PUMA蛋白的活化水平，促進(jìn)細(xì)胞中Bax mRNA的表達(dá)，下調(diào)Bcl-2 mRNA的表達(dá)。這可能是高表達(dá)PUMA基因抑制肺癌細(xì)胞A549生長的分子機制。
　　3、PUMA基因轉(zhuǎn)