紫草素對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖、凋亡影響的機(jī)制研究.pdf

1、肺癌死亡率在世界范圍內(nèi)居惡性腫瘤的首位，5年生存率僅為7％。NSCLC占肺癌的75％-80％左右，化療在其治療中仍發(fā)揮重要作用?？拱┧幬镏饕ㄟ^(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡來(lái)發(fā)揮其治療作用，傳統(tǒng)化療藥因非選擇性殺傷作用和毒副反應(yīng)限制了其臨床應(yīng)用。近年來(lái)，中草藥作為抗腫瘤藥及新的化療佐劑已經(jīng)引起了廣泛的關(guān)注。
　　紫草素(shikonin)是從傳統(tǒng)中藥紫草中分離出的主要活性成分，屬萘醌類化合物，具有多種生物學(xué)活性，主要具有抗炎及抗腫瘤等作用。近

2、年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，紫草素能夠誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡，但其誘導(dǎo)凋亡的確切機(jī)制仍不清楚。
　　p53為抑癌基因，它通過(guò)引起細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡來(lái)維持基因組的穩(wěn)定性，在防止腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演著非常重要的角色。研究表明，p53參與了紫草素誘導(dǎo)的Hela細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞及黑色素瘤細(xì)胞凋亡，p53是否參與了紫草素誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡尚不清楚。
　　磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol3-kinase，PI3K)/

3、Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在維持細(xì)胞生存和抑制細(xì)胞凋亡中起關(guān)鍵作用。在多種腫瘤細(xì)胞中均存在PI3K/Akt通路的異?；罨S多細(xì)胞毒藥物通過(guò)抑制PI3K/Akt通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。但PI3K/Akt通路在紫草素誘導(dǎo)的肺癌細(xì)胞凋亡中的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。
　　Cbl屬泛素化連接酶E3，它參與多種信號(hào)通路的傳導(dǎo)并影響細(xì)胞功能。Cbl參與了MAPK、胰島素通路及PI3K/Akt信號(hào)通路的調(diào)節(jié)。Cbl是否參與了紫草素誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡尚未有報(bào)道。<

4、br>　　目前關(guān)于紫草素誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究尚未有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞為模型，在紫草素誘導(dǎo)其凋亡過(guò)程中對(duì)Bax、Bcl-2及p53等蛋白表達(dá)的情況進(jìn)行了研究，同時(shí)對(duì)PI3k/Akt通路上游分子泛素連接酶Cbl-b及c-Cbl在此過(guò)程中的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了初步探討。
　　材料和方法:
　　1、采用MTT法測(cè)定細(xì)胞活力。
　　2、采用流式細(xì)胞儀通過(guò)PI染色進(jìn)行細(xì)胞周期解析。
　　3、采用流式細(xì)胞儀

5、通過(guò)AnnexinⅤ-PI雙染進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)。
　　4、采用Hoechst33342染色，共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞核染色質(zhì)凝集及核碎裂。
　　5、采用Western-blot檢測(cè)Bcl-2、Bax、p53、Akt，p-Akt、Cbl-b和c-Cbl蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1、MTT結(jié)果顯示紫草素對(duì)A549細(xì)胞的增殖抑制呈時(shí)間及劑量依賴性，24h及48h抑制細(xì)胞增殖50％的藥物濃度(IC50)分別為1.75u

6、mol/L及1.25umol/L。
　　2、PI單染流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示紫草素誘導(dǎo)A549細(xì)胞出現(xiàn)G2/M期阻滯，1.5 umol/L及1.8umol/L紫草素作用24h的G2/M期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)分別為12.65±2.24％(P＜0.05)及17.27±3.27％(P＜0.01)。
　　3、AnnexinⅤ-PI雙染流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡分析表明，紫草素作用于A549細(xì)胞24h，隨濃度的增高，早期凋亡和晚期凋亡細(xì)胞的比例都逐漸

7、增加，與對(duì)照組相比差異具有顯著性(P＜0.01)。
　　4、紫草素作用于A549細(xì)胞24h，經(jīng)Hoechst33342染色，共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞出現(xiàn)明顯的染色質(zhì)凝集及核碎裂。
　　5、Westem-blot結(jié)果顯示紫草素能明顯上調(diào)A549細(xì)胞的p53及Bax蛋白表達(dá)，下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)。
　　6、1.8umol/L的紫草素分別作用于A549細(xì)胞4-24h，p-Akt蛋白表達(dá)在4h開(kāi)始下降，24h時(shí)時(shí)達(dá)最小表達(dá)，而

8、總Akt蛋白水平?jīng)]有變化，提示紫草素可抑制PI3K/Akt信號(hào)通路。預(yù)先用PI3K特異性抑制劑LY294002處理A549細(xì)胞1小時(shí)，然后加入1.8umol/L的紫草素繼續(xù)作用24h，MTT結(jié)果顯示細(xì)胞增殖抑制率由單藥紫草素組的48.06±3.21％增加至72.43±5.62％(P＜0.01)。流式分析儀顯示細(xì)胞凋亡率由17.58±2.57％增加至42.61±4.36％(P＜0.01)，而LY294002單獨(dú)作用24h僅輕度抑制A549

9、細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)少量細(xì)胞凋亡，說(shuō)明LY294002與紫草素在抑制A549細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)凋亡方面具有協(xié)同作用。
　　7、1.8umol/L紫草素分別作用A549細(xì)胞4-24h，Wester-blot結(jié)果顯示Cbl-b及c-Cbl蛋白表達(dá)在4h時(shí)開(kāi)始增加，24小時(shí)時(shí)達(dá)最大表達(dá)，兩者上調(diào)時(shí)間與Akt活性被抑制的時(shí)間一致。用PS-341預(yù)處理細(xì)胞1小時(shí)，加入1.8umol/L紫草素繼續(xù)作用24h，結(jié)果顯示，PS-341逆轉(zhuǎn)了紫草素對(duì)Akt活

10、性的抑制作用及對(duì)A549細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用，提示Cbl-b及c-Cbl通過(guò)負(fù)性調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號(hào)通路參與了紫草素誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡。
　　結(jié)論:
　　1、紫草素以時(shí)間和劑量依賴性方式抑制肺癌A549細(xì)胞增殖。
　　2、紫草素能夠誘導(dǎo)A549發(fā)生G2/M期阻滯及細(xì)胞凋亡，同時(shí)上調(diào)了p53及Bax蛋白表達(dá)，下調(diào)了Bcl-2蛋白表達(dá)。
　　3、紫草素在誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞凋亡過(guò)程中抑制了PI3K/Akt通路，