BEZ235對肺癌A549細胞增殖及miRNA表達的影響.pdf

1、目的：
　　肺癌是全世界癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一，2012年，肺癌是全球最常診斷的癌癥，肺癌發(fā)病率約占總量的13.0％。大約85％-90％的肺癌為非小細胞肺癌(NSCLC)，根據(jù)腫瘤細胞的大小，形狀，和組成，可將非小細胞肺癌分為三個亞型:其中腺癌占40％，鱗狀細胞癌占25％-30％，大細胞癌占10％-15％[3]。在中國，非小細胞肺癌占肺癌患者的75％-80％，其中大多數(shù)患者診斷時已在腫瘤后期階段，已不能接受手術(shù)治療，即使能夠接

2、受根治性手術(shù)治療，大多數(shù)患者由于復發(fā)和轉(zhuǎn)移，多預后不良。到目前為止，藥物治療仍是晚期階段NSCLC的治療的重要方法[1、4、5]。NVP-BEZ235(BEZ235)是一種新型磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的雙重抑制劑，表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤作用且作用范圍廣泛，對惡性腫瘤如乳腺癌、膠質(zhì)母細胞瘤、多發(fā)性骨髓瘤和非小細胞肺癌有抑制作用。小分子核糖核酸(microRNA)是非編碼RNA分子，能夠在轉(zhuǎn)錄后水平抑制

3、基因表達[6]。一個miRNA可以與多個不同的mRNA結(jié)合，結(jié)果導致細胞復雜的增殖過程發(fā)生改變，如信號、生長、分化、和轉(zhuǎn)換[7-10]。鑒于miRNA有這樣至關(guān)重要的作用，他們的表達失調(diào)在許多癌癥類型，包括非小細胞肺癌[7]、前列腺癌、乳腺癌和胰腺癌中已被報道[9、10、12]。研究表明，在癌癥中特定的miRNA可作為強大的腫瘤抑制基因或致癌基因發(fā)揮作用。他們也可能作為在疾病發(fā)生和/或發(fā)展過程中的重要生物標記物[7、8]。本實驗就BEZ

4、235作用于肺癌細胞系A549后，A549細胞增殖及miRNA表達的影響。
　　方法：
　　一、實驗材料
　　BEZ235購自上海翊圣生物科技有限公司，胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料研究所，RPMI1640培養(yǎng)液和2.5g/L胰蛋白酶購自美國Gibco公司，二甲基亞砜(DMSO)和MTT購白Sigma公司，A549細胞株由中國醫(yī)科大學盛京醫(yī)院中心實驗室提供。
　　二、細胞培養(yǎng)與分組
　　A549細胞用含

5、體積分數(shù)10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液(內(nèi)含青霉素100kU/L，鏈霉素100mg/L)，置于體積分數(shù)5％CO2、37℃恒溫孵箱中培養(yǎng)，每1～2天傳代1次，取對數(shù)生長期細胞進行實驗實驗分為4組，對照組（僅含細胞和培養(yǎng)液而不含藥物），BEZ235低、中、高劑量組(分別加入2.5、5和10μmol/L BEZ235)，培養(yǎng)24、48、72h。
　　三、細胞增殖抑制率檢測
　　取對數(shù)生長期的A549細胞，經(jīng)胰蛋白酶消化后制

6、成單細胞懸液，接種于96孔板，每孔100uL，細胞密度約為5000個/孔，置恒溫培養(yǎng)箱中孵育24h后吸出原培養(yǎng)液，按照2中分組處理，每組設6個復孔實驗中止前4h，每孔加入20μL、5g/L的MTT培養(yǎng)4h后，再加入150μLDMSO，振蕩10分鐘，以空白對照孔調(diào)零，在492nm波長處用自動酶標儀測定每孔的吸光度(A)值。細胞增殖抑制率(％)=(1-實驗組平均OD值/對照組平均OD值)X100％。
　　四、Hoechst33258熒

7、光染色及流式細胞儀分析
　　A549細胞(1×106)接種于6孔板，過夜時期貼壁，加入含有不同濃度BEZ235(0，2.5，5，和10μmol/L)繼續(xù)培養(yǎng)24小時.PBS洗兩次、吹干、固定、PBS再洗一次，加入Hoechst33258熒光染料，熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡形態(tài)并拍照，每組實驗重復3次。通過使用Annexin VFITC/PI凋亡試劑盒流式細胞術(shù)分析來確定在A549細胞的細胞凋亡率。A549細胞(1x106)接種于6孔

8、板，過夜時期貼壁，加入含有不同濃度BEZ235(0，2.5，5，和10μmol/L)繼續(xù)培養(yǎng)24小時。消化、收集、
　　五、miRNA表達譜的芯片分析
　　芯片合成后進行QC質(zhì)檢，Pass之后水洗晾干，用于下一步正式雜交實驗;細胞樣品直接用Trizol法提取RNA，提取所得RNA通過紫外分光光度計、瓊脂糖凝膠電泳和Agilent2200Bioanalyzer進行質(zhì)檢（A260/A280≥1.5，A260/A230≥1，RIN

9、 value≥7）;RNA質(zhì)檢合格后進行分裝-80°保存;取0.5-2ug的Total RNA使用ULS標記法標記上cy3，通過紫外分光光度計測得A260，A550，根據(jù)實驗報告所列公式計算標記率DOL（DOL最佳范圍是1.0-3.6）;預雜交:芯片在無菌去離子水中65℃孵育10min;換預雜交液37℃孵育1h;將Cy3標記的RNA全部用于配置雜交液，雜交液95℃變性3min，冰上孵育20S;將芯片預雜交液吸出，換雜交液，37℃雜交16

10、h;芯片取出依次用6X SSPET，3X SSPET，0.5X SSPET，0.5X SSPET洗一遍，去除非特異性雜交背景;加顯影液及蓋玻片于雜交區(qū)域，進行掃描;掃描后所得圖片提取數(shù)據(jù)，進行生物信息學分析。
　　六、miRNA的分類.
　　在微陣列上被測得的總的miRNA中，選擇153個人類的miRNA作進一步分析。將標記物出現(xiàn)在至少一個樣品中的miRNA過濾并應用于倍數(shù)變化分析。
　　七、miRNAs的靶基因預測<

11、br>　　候選miRNA是通過網(wǎng)站http://microna.sanger.ac.uk/targets/v5/篩選出來的。，人類與血管生成、細胞凋亡、染色質(zhì)修飾、細胞分化相關(guān)的相關(guān)基因是從基因本體網(wǎng)站http://geneontology.org篩選出來的。
　　結(jié)果：
　　BEZ235能夠抑制A549細胞增殖，且呈濃度和時間依賴性。不同濃度BEZ235作用于A549細胞24h后，A549細胞的凋亡率隨BEZ235濃度的升