BEZ235體外抑制宮頸癌增殖與遷移作用研究及Skp2過表達(dá)的臨床意義.pdf

1、研究背景：宮頸癌作為女性第二大惡性腫瘤，發(fā)病率僅次于乳腺癌。BEZ235是磷脂酰肌醇-3（PI3K）及其下游因子哺乳動(dòng)物雷帕毒素蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）的雙重靶向抑制劑，已表現(xiàn)出抑制多種腫瘤的作用，但在宮頸癌組織中的作用報(bào)道較少。S期激酶相關(guān)蛋白2（Skp2）是在調(diào)控細(xì)胞周期中發(fā)揮重要作用的蛋白，并參與細(xì)胞的增殖及凋亡。目前已發(fā)現(xiàn)Skp2蛋白在多種惡性腫瘤中呈過表達(dá)且導(dǎo)致腫瘤患者的不良

2、預(yù)后。文獻(xiàn)報(bào)道，Skp2對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展的影響受PI3K信號(hào)通路的調(diào)控。在多種惡性腫瘤中，PI3K信號(hào)通路均可在轉(zhuǎn)錄和翻譯前、后水平上對(duì)Skp2蛋白進(jìn)行調(diào)控。
　　研究目的：探討宮頸癌細(xì)胞中PI3K抑制劑BEZ235通過下調(diào)Skp2影響宮頸癌細(xì)胞的增殖及遷移能力；探討Skp2蛋白在宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中表達(dá)的臨床病理學(xué)意義。
　　材料和方法：第一部分：宮頸癌Hela、C33A、SiHa細(xì)胞的傳代培養(yǎng)；噻唑藍(lán)（MTT）實(shí)驗(yàn)檢測(cè)BE

3、Z235對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)及增殖情況的影響，并繪制生長(zhǎng)曲線，篩選藥物濃度；Hela和C33A細(xì)胞中加入0.1μM、0.4μM的BEZ235藥物，對(duì)照組加入等體積的DMSO，作用48h后，提取RNA及蛋白，通過RT-PCR法檢測(cè)宮頸癌細(xì)胞中Skp2 mRNA的變化，并用Western-blot法檢測(cè)宮頸癌細(xì)胞中Skp2、Ezrin、Six1蛋白的變化；劃痕實(shí)驗(yàn)法檢測(cè)BEZ235對(duì)Hela細(xì)胞遷移能力的影響。第二部分：免疫組化方法檢測(cè)在25例正常宮

4、頸上皮組織、84例宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）和163例宮頸鱗狀細(xì)胞癌（SCC）中Skp2蛋白的表達(dá)情況；RT-PCR法檢測(cè)人乳頭瘤病毒（HPV）在宮頸癌不同組織中的表達(dá)情況；結(jié)合宮頸癌HPV感染情況、臨床分期等生物學(xué)特點(diǎn)檢驗(yàn)Skp2蛋白在宮頸癌組織表達(dá)的臨床病理學(xué)意義；統(tǒng)計(jì)學(xué)分析Skp2蛋白表達(dá)對(duì)患者生存時(shí)間的影響。
　　結(jié)果：第一部分：MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，用BEZ235阻斷PI3K信號(hào)通路可抑制宮頸癌細(xì)胞Hela、C33A和SiH

5、a的增殖；RT-PCR和Western blot結(jié)果表明，宮頸癌Hela和C33A細(xì)胞中Skp2 mRNA和Skp2、Ezrin、Six1蛋白的表達(dá)水平均隨BEZ235的濃度（0.1μM,0.4μM）增高而降低；劃痕試驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞進(jìn)行BEZ235藥物處理24h、48h后，細(xì)胞移動(dòng)距離較對(duì)照組明顯縮短。第二部分：RT-PCR檢測(cè)HPV mRNA在14例宮頸癌組織中有11例呈陽性表達(dá)；Skp2在CIN-1、CIN-2和C

6、IN-3中的陽性率依次增高，且均高于正常組織（P均＜0.01）；在宮頸鱗狀細(xì)胞癌中Skp2蛋白呈明顯的彌漫性強(qiáng)陽性染色，其陽性率顯著高于正常宮頸上皮組織（P<0.01）；Skp2蛋白表達(dá)與FIGO分期及高危型HPV感染關(guān)系密切（P<0.05）； Skp2蛋白陽性表達(dá)的宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者無瘤生存率及總生存率明顯低于陰性表達(dá)的患者（P均<0.01）。
　　結(jié)論：1. PI3K抑制劑BEZ235通過下調(diào)Skp2蛋白抑制宮頸癌細(xì)胞增殖與遷