BEZ235和TSA協(xié)同抑制肺癌機(jī)制及Ezrin蛋白的標(biāo)志物作用研究.pdf

1、研究背景：肺癌是發(fā)病率及死亡率均占第一位的惡性腫瘤，全球以及我國(guó)的肺癌發(fā)病率正呈逐年遞增的趨勢(shì)?，F(xiàn)已公認(rèn)，轉(zhuǎn)移及耐藥是導(dǎo)致肺癌患者死亡的主要原因，因此，明確肺癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制、發(fā)現(xiàn)有效的治療靶點(diǎn)是克服肺癌的關(guān)鍵。PI3K抑制劑BEZ235和組蛋白去乙酰化酶抑制劑曲古抑菌素A（TSA）是有效的小分子靶向腫瘤治療藥物，但高劑量用藥后的副作用及耐藥性限制了其療效。最近研究表明，不同的分子靶向治療藥物聯(lián)合用藥可以明顯降低用藥劑量，且顯示出較好的克服

2、耐藥及協(xié)同抑制腫瘤的作用，有關(guān)BEZ235與TSA聯(lián)合應(yīng)用在胰腺癌和前列腺癌中的研究已有明確報(bào)道，但在肺癌中的作用及機(jī)制尚不清楚。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，Ezrin基因及其蛋白在乳腺癌和宮頸癌等上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中起重要作用，是一種重要的癌蛋白。因此，深入研究Ezrin在BEZ235與TSA聯(lián)合應(yīng)用抑制肺癌中的作用有重要的理論指導(dǎo)意義。
　　研究目的：本研究通過體內(nèi)外分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)研究BEZ235和TSA聯(lián)合用藥對(duì)A549肺癌細(xì)胞生物學(xué)

3、行為的影響，分析其協(xié)同抑制腫瘤的作用及機(jī)制，并初步探討 Ezrin信號(hào)通路在BEZ235和TSA聯(lián)合抑制肺癌中作用及其預(yù)后判定指標(biāo)作用，為肺癌臨床治療提供新的用藥選擇及分子標(biāo)志物。
　　材料和方法：
　　1）體外實(shí)驗(yàn)：MTT及平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)BEZ235及TSA聯(lián)合用藥對(duì)肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549的增殖抑制作用；流式細(xì)胞術(shù)Annexin-V/PI雙染法及Hoechst3334熒光染色法檢測(cè)藥物處理后的A549細(xì)胞凋亡率的變化；W

4、estern blot方法檢測(cè)BEZ235及TSA處理后PI3K/Akt、HDAC及Ezrin信號(hào)通路的相關(guān)蛋白改變及對(duì)EMT標(biāo)志物的影響。進(jìn)一步以siRNA方法沉默Ezrin的表達(dá)后檢測(cè)誘導(dǎo)EMT的能力，明確Ezrin與EMT的相關(guān)性。通過劃痕實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證兩藥協(xié)同抑制A549細(xì)胞遷移的能力；
　　2）體內(nèi)實(shí)驗(yàn)部分：建立A549細(xì)胞系裸鼠移植瘤模型，隨機(jī)分成單獨(dú)給藥、聯(lián)合給藥及對(duì)照組。連續(xù)給藥4周后檢測(cè)兩藥合用對(duì)A549移植瘤的協(xié)同抑

5、制能力，并將瘤組織制成病理切片后，免疫組化分析Ki67、Ezrin及p-Ezrin蛋白的表達(dá)情況；RT-PCR方法對(duì)比分析21例新鮮肺癌、15例癌旁及8例正常肺組織的Ezrin，p-Ezrin的mRNA表達(dá)情況；免疫組化方法檢測(cè)150例NSCLC、癌旁組織及正常組織的Ezrin，p-Ezrin的蛋白表達(dá)情況，并分析其異常表達(dá)與臨床病理學(xué)特征之間的相關(guān)性，生存期分析驗(yàn)證Ezrin及p-Ezrin對(duì)患者預(yù)后評(píng)估的價(jià)值。
　　結(jié)果：

6、r>　　1）MTT及平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示BEZ235與TSA協(xié)同抑制A549細(xì)胞的增殖及克隆形成能力；流式細(xì)胞術(shù)及Hoechst染色結(jié)果表明聯(lián)合用藥增強(qiáng)A549細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)能力；Western blot結(jié)果顯示BEZ235及TSA下調(diào)PI3K/Akt及HDAC相關(guān)信號(hào)通路蛋白；劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，聯(lián)合用藥抑制A549的損傷愈合能力；
　　2）BEZ235及TSA協(xié)同抑制A549細(xì)胞的裸鼠移植瘤成瘤能力，且聯(lián)合用藥組腫瘤組織壞死增多

7、，Ki67、Ezrin及p-Ezrin表達(dá)均下調(diào)；
　　3）BEZ235及TSA聯(lián)合用藥誘導(dǎo)A549細(xì)胞EMT形成，如E-cad表達(dá)增高，snail表達(dá)下調(diào)；siRNA方法沉默A549細(xì)胞Ezrin基因后，Western blot檢測(cè)顯示A549細(xì)胞間質(zhì)細(xì)胞表型得到增強(qiáng)；
　　4）RT-PCR方法檢測(cè)顯示肺癌組織Ezrin的mRNA水平明顯高于癌旁正常組織；免疫組化結(jié)果表明，Ezrin、EzrinThr-567及EzrinT

8、yr-353的陽性率（62.7％、63.3%、71.3%）明顯高于癌旁組織（31.3%、14.0%、11.3%）及正常肺組織（35.7%、14.3%、7.1%），差異具有顯著性，并與患者的臨床分級(jí)，病理分化，有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)；生存期分析結(jié)果表明EzrinThr-567的異常表達(dá)與NSCLC的生存期密切相關(guān)，而在早期NSCLC中Ezrin與EzrinThr-567均與生存期密切相關(guān)。
　　結(jié)論：
　　1）BEZ235與T