結核易感標志物和血清標志物的研究.pdf

1、結核病，是由結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）引起并經呼吸道傳播的一種慢性傳染病，嚴重的危害人類健康。病原菌主要侵入人體的肺部，以肺結核病(pulmonary tuberculosis，PTB）最為常見。近年來，由于人類免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus，HIV）流行、藥物的濫用導致MTB耐藥的出現(xiàn)，再加上人們對結核菌并沒有引起足夠重視，使得世界范圍內的結核病

2、又死灰復燃。盡管全球通過擴展直接觀察與短程治療戰(zhàn)略及投入大量的資金來提高結核病治療的完成率，但低下的疾病病例檢出率仍然是結核病控制的主要障礙，導致結核病成為發(fā)病率和死亡率最高的感染性疾病之一。提高病人的檢出率并及時治療病人是有效控制結核病傳染源，遏制結核病流行的最重要措施。目前臨床上結核病的診斷方法有多種，都由于各種原因都無法滿足臨床上輔助診斷與指導用藥的需要，因此，迫切需要發(fā)現(xiàn)新的標志物應用于發(fā)現(xiàn)病人和結核病的有效防控。
　　血

3、清中的蛋白具有非常重要的生理功能，主要包括參與人類機體的代謝、免疫、運輸、物質交換、信號調節(jié)、凝血作用。在病理狀態(tài)下血清中低豐度蛋白質的組成和數(shù)量通常會發(fā)生變化，因此這些具有重要生物學功能的表達量很低的蛋白質對于疾病的監(jiān)測和診斷有著重要的意義。為了發(fā)現(xiàn)結核病的血液標志物，首先需要確定結核病人特別是肺結核病病人是否存在血液標志物，因此，本研究第一部分針對近年來結核的易感標志物研究進行系統(tǒng)的文獻分析。研究發(fā)現(xiàn)，結核的遺傳易感性是由多基因所決

4、定的，其中有關人類白細胞抗原(human leucocyte antigen，HLA)等位基因多態(tài)性與結核病易感性的相關性備受關注。因此，通過對現(xiàn)有文獻的分析從基因水平上確認在血液中可以找到與結核病相關的易感性標志物。
　　基因是遺傳信息的攜帶者，而生命活動的執(zhí)行者卻是蛋白質，與易感性基因標志物相比，蛋白質標志物可能與結核病的相關性更大。相對和絕對定量的同位素標記（isobaric tags for relative and ab

5、solute quantitation，iTRAQ）標記的基質輔助激光解吸離子化飛行時間質譜（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-fight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）作為新學科及蛋白組學研究技術平臺，為發(fā)現(xiàn)肺結核病的血清標志物提供了新思路，蛋白質組學及其相關技術讓人類能夠熟知細胞和生命有機體在特定時間和空間內所表達的全部蛋白質。因此

6、，本研究的第二和第三部分利用相對定量的蛋白組學技術發(fā)現(xiàn)和驗證血清蛋白性激素結合球蛋白（sex hormone-binding globulin，SHBG）、微管蛋白α-3E鏈（Tubulin alpha-3E chain，TBA3E）分別作為肺結核病和耐多藥肺結核病的有價值的候選標志物。
　　第一部分結核病易感標志物的關聯(lián)性分析
　　目的：采用Meta分析的方法對國內外已發(fā)表的有關于HLA-DRB1、HLA-DQ基因多態(tài)性與

7、結核病易感性的文獻進行綜合分析，尋找結核病相關的易感基因。
　　方法：在PubMed和EMBASE中，應用關鍵詞"Mycobacterium tuberculosis"、"tuberculosis"、"MTB"或"TB"、"HLA-DRB1"、"HLA-DQA1"或"HLA-DQB1"或"human leukocyte antigen"或"HLA antigen"、"Polymorphism"、"Polymorphisms"、或"

8、Genetic polymorphism"搜索1980年1月到2014年6月期間發(fā)表的相關英文文獻。應用 Stata 版本 11.2軟件包對納入的研究結果進行數(shù)據(jù)分析。
　　結果：最終分別有21篇和12篇關于HLA-DRB1基因和HLA-DQ基因多態(tài)性與結核病易感性的關系的文獻符合標準并納入研究。研究結果表明HLA-DRB1*15、DRB1*08:03和DQB1*0601等位基因多態(tài)性增加結核病風險（DRB1*15：OR=1.49

9、，95％CI：1.13-1.97，P=0.005；DRB1*08:03：OR=1.90，95%CI：1.25-2.90，P=0.003），而HLA-DRB1*03、HLA-DRB1*11、DRB1*11:03和DRB1*12:02等位基因多態(tài)性降低結核病風險（DRB1*03：OR=0.82，95%CI：0.68-0.99，P=0.049；DRB1*11：OR=0.71，95%CI：0.54-0.93，P=0.013；DRB1*11:03

10、：OR=0.3，95%CI：0.1-0.4，P=0.028；DRB1*12:02:：OR=0.62，95%CI：0.39-0.98，P=0.043）。亞組分析結果表明DRB1*03和DRB1*07:01等位基因多態(tài)性會降低亞洲人群結核病的發(fā)病風險（DRB1*15：OR=0.78，95%CI：0.62-0.99，P=0.037；DRB1*07:01：OR=0.71，95%CI：0.53-0.95，P=0.020），而DRB1*15、DRB

11、1*08:03 和DQB1*0601等位基因多態(tài)性增加亞組人群結核病的發(fā)病風險（DRB1*15：OR=1.80，95%CI：1.48-2.20，P=0.000；DRB1*08:03：OR=1.91，95%CI：1.25-2.92，P=0.003）。HLA-DQA1等位基因多態(tài)性與結核發(fā)病風險無明顯的關聯(lián)。
　　結論：HLA-DRB1和HLA-DQB1等位基因多態(tài)性與結核病強相關，可能是其易感標志物。HLA-DQA1等位基因多態(tài)性與

12、結核發(fā)病風險無明顯的關聯(lián)。
　　第二部分 基于iTRAQ標記結合MALDI-TOF-MS技術發(fā)現(xiàn)肺結核病血清潛在標志物
　　目的：應用相對定量蛋白組學技術篩選肺結核病與對照組血清中的差異表達蛋白并驗證潛在標志物，為肺結核病防控提供有價值的血清候選標志物。
　　方法：采用相對和絕對定量的穩(wěn)定同位素(isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ)標記結

13、合MALDI-TOF-MS技術分析五組樣本的血清蛋白組，即7例耐多藥肺結核病（multi-drug resistant pulmonary tuberculosis，MDR-PTB）、30例涂陰肺結核?。╯mear-negative pulmonary tuberculosis，SNP-TB）、10例涂陽肺結核病（smear-positive pulmonary tuberculosis，SPP-TB）、30例健康對照和10例肺炎血清差

14、異表達蛋白；生物信息學分析差異蛋白的功能；對潛在標志物SHBG蛋白表達水平進行系列驗證，包括應用免疫組化(Immunohistochemistry，IHC)驗證40例肺結核病和10例對照組織，ELISA驗證 24例健康對照、35例耐多藥肺結核病、55例涂陽肺結核病、70例涂陰肺結核病和15例肺炎的血清標本，Western Blot驗證30例健康對照、7例耐多藥肺結核病、10例涂陽肺結核病、30例涂陰肺結核病和10例肺炎的血清標本。根據(jù)E

15、LISA的結果繪制受試者工作特征曲線 (receiver operating characteristic curve，ROC)并分析相關指標。
　　研究結果：相對定量蛋白組學共鑒定和篩選出肺結核病血清26個差異表達蛋白(包括16個蛋白上調表達和10個蛋白下調表達)。ELISA方法分析發(fā)現(xiàn)SHBG蛋白在肺結核病中表達水平增高（耐多藥肺結核病組：181.76±200.09 nmol/L、涂陽肺結核病組：160.43±75.45 nm

16、ol/L、涂陰肺結核病組：159.75±75.47 nmol/L、肺炎組：60.63±59.38 nmol/L、健康對照組：33.39±34.24 nmol/L；p<0.0001），IHC和Western Blot方法的驗證結果也表明SHBG蛋白在肺結核病中表達水平增高（p<0.05），三種驗證方法的表達趨勢與蛋白組學篩選的結果完全一致。ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)SHBG蛋白鑒別肺結核病與肺炎、健康對照的準確性、靈敏性、特異性和AUC分別為78

17、.74%、75.6%、91.53%和0.981。
　　結論：建立蛋白組學篩選和鑒定肺結核病血清差異表達蛋白的技術平臺；血清SHBG蛋白鑒別肺結核病與肺炎、健康對照的具有較高準確性、靈敏度和特異度；是肺結核病防控有價值的血清候選標志物。
　　第三部分 基于iTRAQ標記結合MALDI-TOF-MS技術發(fā)現(xiàn)耐多藥肺結核病血清潛在標志物
　　目的：應用相對定量蛋白組學技術篩選耐多藥肺結核病與對照血清中的差異表達蛋白，進一步應

18、用ELISA和質譜多反應監(jiān)測(multiple reaction monitoring，MRM)技術驗證潛在的標志物。
　　方法：采用iTRAQ標記結合MALDI-TOF-MS技術分析四組血清樣本的蛋白，包括7例耐多藥肺結核病、30例涂陰肺結核病、30例健康對照組和10例肺炎組，并通過Proteinpilot軟件篩選與鑒定耐多藥肺結核病相關的差異蛋白；應用生物信息學分析顯著差異蛋白的細胞成分、分子功能和生物過程；對潛在標志物TBA

19、3E、纖連蛋白(Fibronectin 1，F(xiàn)N1)和玻連蛋白（Vitronectin，VTN）的表達水平進行驗證，ELISA驗證19例健康對照、15例肺炎、22例涂陰肺結核病和 13例耐多藥肺結核病血清標本中TBA3E蛋白表達水平；以及26例健康對照、26例肺炎、25例涂陰肺結核病和 27例耐多藥肺結核病血清標本中VTN表達水平；MRM技術驗證蛋白VTN和FN1在10例健康對照、10例肺炎、10例涂陰肺結核病和10例耐多藥肺結核病血清

20、標本表達水平。繪制ROC曲線并分析相關指標。
　　結果：比較涂陰肺結核病、健康對照、肺炎血清蛋白組，在耐多藥肺結核病血清中共鑒定和篩選出17個差異表達蛋白(包括9個蛋白上調表達和8個蛋白下調表達)。經ELISA方法分析發(fā)現(xiàn)TBA3E蛋白在耐多藥肺結核病中表達水平增高（耐多藥肺結核病組：311.31±161.73μg/ml、涂陰肺結核病組：6.17±6.29μg/ml、肺炎組：6.38±7.72μg/ml、健康對照組：53.73±2

21、0.05μg/ml；p<0.0001），表達趨勢與iTRAQ的結果完全一致。ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)TBA3E蛋白鑒別耐多藥肺結核病與肺炎、健康對照、涂陰肺結核病的準確性、靈敏性、特異性和AUC為91.07%、84.6%、94.6%和0.949。經MRM分析發(fā)現(xiàn)蛋白FN1和VTN在耐多藥肺結核病中表達水平降低，表達趨勢與蛋白組學篩選的結果完全一致，但VTN蛋白的ELISA結果與蛋白組學篩選的結果不一致。
　　結論：TBA3E蛋白鑒別耐多