組蛋白去乙?；敢种苿㏕SA、DP與紫杉醇協(xié)同對非小細(xì)胞肺癌的抑制作用和機制.pdf

1、目的：探討組蛋白去乙?；敢种苿┡c紫杉醇聯(lián)合應(yīng)用，協(xié)同抑制NSCLC細(xì)胞系的作用和機制。 方法：1.采用體外藥物敏感試驗(MTT比色法)，分別觀察不同給藥時間TSA、DP和紫杉醇協(xié)同對NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549、H322及H1299的抑制作用；實驗共分設(shè)10組：①正常對照組(contro1)；②紫杉醇96h組(TAX)；③DP12h組(DP)；④DP作用12h后換為紫杉醇84h組(DF)，12h時換培養(yǎng)液；⑤DP與紫杉醇同時加用組

2、(DTST)，DP與紫杉醇同時加入培養(yǎng)基中，12h換液，去除DP，紫杉醇繼續(xù)作用84h；⑥紫杉醇作用84h后換為DP作用12h組(DB)，84h時換培養(yǎng)液；⑦TSA12h組(TSA)；⑧TSA作用12h換為紫杉醇84h組(TF)，12h時換培養(yǎng)液；⑨TSA+紫杉醇同時加用組(TTST)，TSA作用12h，紫杉醇再作用84h，12h時換培養(yǎng)液；⑩紫杉醇作用84h后換為TSA作用12h組(TB)，84h時換培養(yǎng)液；聯(lián)合用藥時每孔TSA用藥濃

3、度為300nM，DP用藥濃度為25ng/ml，觀察TSA、DP分別與紫杉醇聯(lián)合應(yīng)用對H1299和H322細(xì)胞系的協(xié)同抑制效果。2.采用流式細(xì)胞儀檢測TSA、DP分別與紫杉醇聯(lián)合應(yīng)用早期對H1299和H322細(xì)胞系的細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡的變化。分組方法同方法1，紫杉醇作用時間調(diào)整為24h。TSA用藥濃度為300nM，DP用藥濃度為25ng/ml，紫杉醇用藥濃度為10uM。3.采用Western免疫印跡法檢測聯(lián)合應(yīng)用早期p21、survivi

4、n、磷酸化ERK以及PARP蛋白的表達(dá)變化，按方法2的分組進(jìn)行。另外還檢測了A549、H322及H1299細(xì)胞系的HER2表達(dá)水平。5.熒光顯微鏡下觀察按方法3的分組方法，各組Hoechst染色后細(xì)胞核的變化，了解凋亡和細(xì)胞死亡情況。 結(jié)果：1.NSCLC3種細(xì)胞系HER2蛋白表達(dá)水平不同，表達(dá)水平由高到低依次為H322、A549和H1299。2.HDAC抑制劑TSA、DP對體外培養(yǎng)的3種NSCLC細(xì)胞系均具有生長抑制作用，并且

5、這種抑制作用呈現(xiàn)時間依賴性和劑量依賴性。并且TSA、DP對3種細(xì)胞系的IC50值與HER2蛋白表達(dá)水平不相關(guān)。TSA和DP對表達(dá)野生型p53的A549較對其它兩種細(xì)胞系的敏感性高。3.紫杉醇對3種NSCLC細(xì)胞均有明顯的生長抑制作用。紫杉醇對H322、H1299、A549細(xì)胞系的的IC50值分別為28.07nm(r=0.95)、110.6(r=0.92)、9.81nm(r=0.97)。紫杉醇的IC50值同樣與HER2的表達(dá)水平?jīng)]有關(guān)系。

6、4.與紫杉醇聯(lián)合應(yīng)用3組中，DP與TSA均提高了紫杉醇抑制細(xì)胞生長的水平，但根據(jù)CI分析的方法，先用和后用TSA、DP的TF、DF、DB組抑制曲線的各點CI值均＜1，提示TSA先用及DP先用和后用的聯(lián)合方法達(dá)到了協(xié)同效應(yīng)。同時應(yīng)用TSA、DP的TTST、DTST及后用TSA的TB組部分點CI值＜1。提示DP聯(lián)合應(yīng)用紫杉醇，三種聯(lián)合方法都能提高紫杉醇的細(xì)胞生長抑制作用，但先用TSA、DP的方法較后兩種方法更顯示了協(xié)同效果。5.TSA、DP

7、及紫杉醇單獨應(yīng)用，均明顯地誘導(dǎo)H1299和H322細(xì)胞系的p21蛋白的表達(dá)增加；在H1299細(xì)胞系，聯(lián)合應(yīng)用DP和紫杉醇，較單獨應(yīng)用紫杉醇p21表達(dá)水平進(jìn)一步增加；聯(lián)合應(yīng)用TSA和紫杉醇，先用及后用TF、TB組較單獨應(yīng)用紫杉醇p21表達(dá)水平進(jìn)一步增加，但同時應(yīng)用TTST組卻較單獨應(yīng)用紫杉醇組p21蛋白表達(dá)水平下降明顯；在H322細(xì)胞系，除先用DP的DF組p21表達(dá)與TAX組相近外，其余各聯(lián)合應(yīng)用組，p21蛋白表達(dá)均較TAX組明顯下降，以

8、TF、TTST、TB組下降為明顯。6.TSA誘導(dǎo)H1299和H322細(xì)胞系發(fā)生G1期細(xì)胞周期阻滯，DP誘導(dǎo)H1299細(xì)胞G1期，而誘導(dǎo)H322細(xì)胞G2期細(xì)胞周期阻滯。先后應(yīng)用TSA、DP與紫杉醇的聯(lián)合應(yīng)用主要發(fā)生G1期阻滯，而同時應(yīng)用則出現(xiàn)G2期細(xì)胞周期阻滯。聯(lián)合應(yīng)用后G2的細(xì)胞周期阻滯與p21蛋白表達(dá)相對下調(diào)有關(guān)。7.TSA、DP與紫杉醇的聯(lián)合應(yīng)用后在H322細(xì)胞系可以檢測到Caspase3活化后剪切的PARP蛋白，聯(lián)合應(yīng)用組較單獨應(yīng)

9、用組剪切的PARP蛋白水平明顯增加。同時流式細(xì)胞檢測聯(lián)合應(yīng)用組較單獨應(yīng)用，細(xì)胞凋亡增加。而在H1299細(xì)胞系未檢測到剪切的PARP蛋白，流式細(xì)胞檢測聯(lián)合應(yīng)用組較單獨應(yīng)用，細(xì)胞凋亡增加，但凋亡比率小。8.紫杉醇能誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞系H1299和H322的survivin的蛋白高表達(dá)，HDAC抑制劑TSA、DP不僅能下調(diào)NSCLC細(xì)胞系H1299和H322原有survivin的蛋白表達(dá)，而且能抑制紫杉醇誘發(fā)的survivin高表達(dá)。9.紫杉

10、醇能激活NSCLC細(xì)胞系H1299和H322的ERK信號通路，HDAC抑制劑TSA、DP不僅能下調(diào)NSCLC細(xì)胞系H1299和H322磷酸化ERK蛋白的表達(dá)水平，而且能抑制ERK通路的激活。 結(jié)論：1.HDAC抑制劑TSA和DP都能抑制3種NSCLC細(xì)胞系的生長，而這種生長抑制作用與HER2的表達(dá)水平之間沒有明顯的關(guān)系。TSA和DP對NSCLC細(xì)胞系的生長抑制作用的強弱與p53基因的形態(tài)有一定關(guān)系，表達(dá)野生型p53的細(xì)胞系較表達(dá)

11、突變型p53基因的細(xì)胞系更為敏感。p53的基因形態(tài)可能是預(yù)測HDAC敏感性的指標(biāo)之一。而p53基因的變異對紫杉醇的敏感性可能沒有影響。2.HDAC抑制劑TSA、DP與化療藥物紫杉醇聯(lián)合應(yīng)用，可以提高紫杉醇對NSCLC細(xì)胞系H1299和H322的生長抑制功能，按HDAC抑制劑的應(yīng)用順序，HDAC抑制劑先用的方法可以達(dá)到協(xié)同效果。 3.TSA誘導(dǎo)H1299和H322細(xì)胞系發(fā)生G1期細(xì)胞周期阻滯，DP誘導(dǎo)H1299細(xì)胞G1期，而誘導(dǎo)H

12、322細(xì)胞G2期細(xì)胞周期阻滯。先后應(yīng)用TSA、DP與紫杉醇的聯(lián)合應(yīng)用主要發(fā)生G1期阻滯，而同時應(yīng)用則出現(xiàn)G2期細(xì)胞周期阻滯。聯(lián)合應(yīng)用后G2期的細(xì)胞周期阻滯與p21蛋白表達(dá)相對下調(diào)有關(guān)。4.聯(lián)合應(yīng)用的協(xié)同作用在H322細(xì)胞系，表現(xiàn)為細(xì)胞凋亡的增加，而在H1299細(xì)胞系，則可能存在非凋亡因素。5.HDAC抑制劑與紫杉醇的協(xié)同抑制細(xì)胞生長的效應(yīng)與p53的狀態(tài)無關(guān)。HER2的表達(dá)水平也不是協(xié)同治療敏感性的指標(biāo)。6.紫杉醇能誘發(fā)NSCLC細(xì)胞系H

13、1299和H322的survivin的蛋白高表達(dá)，HDAC抑制劑TSA、DP不僅能下調(diào)NSCLC細(xì)胞系H1299和H322原有survivin的蛋白表達(dá)，而且能抑制紫杉醇誘發(fā)的survivin高表達(dá)。上述作用可能是HDAC抑制劑聯(lián)合紫杉醇協(xié)同抑制肺癌細(xì)胞的機制之一。 7.紫杉醇能激活NSCLC細(xì)胞系H1299和H322的ERK信號通路，HDAC抑制劑TSA、DP不僅能下調(diào)NSCLC細(xì)胞系H1299和H322磷酸化ERK蛋白的表達(dá)