雙靶點(diǎn)抑制劑BEZ235克服Gefitinib耐藥的肺腺癌H1975細(xì)胞的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分 Geftinib耐藥的肺腺癌 H1975細(xì)胞株的特征鑒定
　　目的:本研究的目的是為了驗證肺腺癌 H1975細(xì)胞株是否具有特征性的突變位點(diǎn)及其對 Geftinib是否耐藥。
　　方法:肺腺癌 H1975細(xì)胞進(jìn)行基因測序明確是否含有 T790M及L858R突變;MTT法進(jìn)行肺腺癌 H1975細(xì)胞 Geftinib耐藥性的鑒定。
　　結(jié)果:基因測序表明 H1975細(xì)胞株

2、含有 EGFR T790M及L858R突變,且對 Geftinib的50％抑制濃度 IC50值為39.176mM,符合 Geftinib耐藥細(xì)胞株的描述;
　　結(jié)論:本實驗用肺腺癌 H1975細(xì)胞含有 T790M及L858R突變,且對 Geftinib耐藥符合肺腺癌 H975細(xì)胞株的特征。
　　第二部分 BEZ235體外對吉非替尼耐藥的肺腺癌 H1975細(xì)胞的作用及其機(jī)制研究
　　目的:通過體外細(xì)胞實驗,探討 PI3K

3、/mTOR雙靶點(diǎn)抑制劑 BEZ235對 Geftinib耐藥的肺腺癌 H1975細(xì)胞株增殖的影響及其對 H1975細(xì)胞 PI3K/Akt/mTOR信號通路的作用,試圖明確在體外實驗中BEZ235能否通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路從而克服 T790M突變導(dǎo)致的Gefitinib耐藥。
　　方法:MTT分析法初步明確 BEZ235單用或與 Geftinib聯(lián)合對肺腺癌 H1975細(xì)胞增殖抑制的影響;細(xì)胞劃痕試驗檢測 BEZ

4、235和Geftinib的不同組合對 H1975細(xì)胞遷移能力的影響;Transwell小室侵襲試驗了解 BEZ235和Geftinib不同組合對 H1975細(xì)胞侵襲能力的影響;流式細(xì)胞術(shù)測定經(jīng) BEZ235和Geftinib作用后各組 H1975細(xì)胞周期分布及凋亡情況;RT-PCR法檢測BEZ235和Geftinib對H1975細(xì)胞PIK3CA、mTOR、VEGF基因轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)的影響;細(xì)胞免疫熒光法檢測 BEZ235和Geftinib

5、對 H1975細(xì)胞 p-mTOR的表達(dá)定位,初步判定表達(dá)的變化;Western blot檢測 BEZ235和Geftinib對 H1975細(xì)胞 PI3K/ Akt/mTOR信號通路蛋白 AKT、p-AKT、S6、p-S6的影響。
　　結(jié)果:BEZ235單獨(dú)作用于 H1975細(xì)胞的IC50為0.327mM,且有明顯的濃度依賴性;與Geftinib聯(lián)合后BEZ235的IC50值為0.073mM,與單用BEZ235有顯著差異(P<0.0

6、5)。BEZ235與 Geftinib聯(lián)合對 H1975細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響比 Geftinib單用差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);BEZ235單用或與 Gefitinib聯(lián)合使 H1975細(xì)胞的凋亡增加,與 Geftinib組及空白組相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),但 G1期阻滯并沒有差異性。BEZ235單用或與 Geftinib聯(lián)合在轉(zhuǎn)錄水平上促進(jìn) PIK3CA的表達(dá),抑制VEGF的表達(dá),兩藥單用或聯(lián)合對 mTOR則均

7、表現(xiàn)為抑制作用;Western blot表明 BEZ235能抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路上磷酸化的p-Akt、p-S6蛋白表達(dá),而對總 Akt及S6蛋白的表達(dá)無顯著影響。
　　結(jié)論:BEZ235單獨(dú)作用于 H1975細(xì)胞對其增殖有抑制作用,與 Geftinib聯(lián)合有協(xié)同性增殖抑制作用,可用于下一步實驗;通過體外實驗表明 PI3K/mTOR雙靶點(diǎn)抑制劑BEZ235能下調(diào) PI3K/Akt/mTOR信號通路上的蛋白磷酸化水平

8、,有效的抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路上腫瘤生長信號向下傳遞,從而克服 EGFR T790M突變導(dǎo)致的Geftinib獲得性耐藥;BEZ235體外試驗中能抑制人肺腺癌 H1975細(xì)胞的遷移和侵襲能力,BEZ235能增加 H1975細(xì)胞凋亡的比例,且隨干預(yù)時間的延長有增加的趨勢。
　　第三部分 BEZ235對 BALB/c裸鼠H1975細(xì)胞移植瘤生長的作用及其機(jī)制研究
　　目的:通過建立 BALB/c裸鼠移植瘤模型,在

9、體探討 BEZ235對 Geftinib耐藥肺腺癌 H1975細(xì)胞 BALB/c裸鼠移植瘤生長的影響及其對 PI3K/Akt/mTOR信號通路的作用,以期明確 BEZ235能否在體內(nèi)也是通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路從而克服Gefitinib耐藥而抑制腫瘤的生長及有無抗血管生成作用。
　　方法:32只 BALB/c裸鼠分成四組,第一組為空白對照組(BLK),第二組為單用Gefitinib組(GEF),第三組為單用BEZ

10、235組(BEZ),第四組為 BEZ235與 Gefitinib聯(lián)合組(B+G),每組8只。BALB/c裸鼠H1975細(xì)胞移植瘤干預(yù)前后腫瘤生長曲線的繪制了解腫瘤生長有無差異;干預(yù)過程中比較 BALB/c裸鼠各組成瘤時間和腫瘤體積有無差異性;干預(yù)后比較各組 BALB/c裸鼠切取的腫瘤重量從而評價干預(yù)效果是否有差異;活體 MRI成像從影像學(xué)方面了解干預(yù)與否對腫瘤生長的影響;通過 H1975細(xì)胞皮下種植建立 BALB/c裸鼠移植瘤模型,BA

11、LB/c裸鼠移植瘤的Western blot檢測BEZ235和(或)Geftinib對 H1975細(xì)胞表達(dá)磷酸化蛋白 p-mTOR、VEGF的影響;各組 BALB/c裸鼠切取腫瘤組織切片免疫組化檢測 VEGF、p-S6、CD31,了解 p-S6表達(dá)有無差異,了解與腫瘤血管生成相關(guān)指標(biāo) VEGF、CD31在腫瘤組織中表達(dá)的是否有差異,以明確在體內(nèi) BEZ235是否有抗血管生成作用。
　　結(jié)果:BALB/c裸鼠移植瘤研究表明 BEZ2

12、35單用或與 Gefitinib聯(lián)合,BALB/c裸鼠H1975細(xì)胞移植瘤的生長延緩;活體 MR成像、干預(yù)過程中測得的腫瘤體積及干預(yù)后切取的腫瘤重量與空白對照組、GEF單用組相比有顯著性差異(P<0.01);BALB/c裸鼠移植瘤 Western blot表明體內(nèi) BEZ235能抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路上p-mTOR表達(dá),VEGF在 BEZ235單用或與 Geftinib聯(lián)合組是下降的;移植瘤免疫組化分析表明 BEZ235

13、單用或與 Geftinib聯(lián)合使 BALB/c裸鼠腫瘤組織中的VEGF和CD31表達(dá)顯著下降,以聯(lián)合組下降最顯著(P<0.01)。
　　結(jié)論:通過移植瘤實驗表明,BEZ235單用或與 Geftinib聯(lián)合干預(yù)后腫瘤的生長曲線顯示 BEZ235單用抑制肺腺癌 H1975細(xì)胞移植瘤的生長,與 Geftinib聯(lián)合有協(xié)同作用;干預(yù)結(jié)束后腫瘤重量、活體 MR成像得出同樣的結(jié)果;在移植瘤模型中BEZ235能降低腫瘤組織中p-S6、CD31、