mdig基因?qū)Ψ蜗侔〢549細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、目的：
　　本實(shí)驗(yàn)通過將mdig siRNA轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞中建立沉默細(xì)胞系，檢測細(xì)胞凋亡和相關(guān)的Caspase-8、Caspase-3，探索mdig基因在凋亡過程中的可能機(jī)制。
　　方法：
　　1、細(xì)胞培養(yǎng)
　　人肺腺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞用含10％熱滅活新鮮胎牛血清的RPMI1640的培養(yǎng)基，在37℃、5％C02的條件下培養(yǎng)。
　　2、siRNA干擾
　　設(shè)計(jì)并合成靶向mdig基因的siRNA(m

2、dig siRNA)及陰性對照siRNA(scramble siRNA)。共分為3組，分別為:空白組、陰性對照組、實(shí)驗(yàn)組。采用Lipofectamine RNAiMAX將siRNA轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞中，在轉(zhuǎn)染后用WB檢測干擾效率。
　　3、蛋白質(zhì)免疫印跡(WB)檢測
　　提取細(xì)胞中的總蛋白;BCA法測定蛋白質(zhì)濃度;蛋白進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)印至PVDF膜;最后用相應(yīng)的抗體檢測相應(yīng)蛋白。
　　4、流式細(xì)胞術(shù)檢測

3、細(xì)胞凋亡
　　轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞用不含EDTA的胰酶消化收集，PBS洗滌細(xì)胞(2000rmp離心5min)加入500ul的Binding Buffer懸浮細(xì)胞，加入5ul Annexin-FITC混勻后，加入5ul Propidium Iodide室溫避光反應(yīng)5-15min，用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞的凋亡率。
　　5、統(tǒng)計(jì)
　　采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05視為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4、　　結(jié)果：
　　1、在A549細(xì)胞中轉(zhuǎn)染mdig siRNA，western blot結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組的mdig表達(dá)情況較對照組明顯減少(p＜0.05)，說明轉(zhuǎn)染成功。
　　2、細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示mdig siRNA能夠抑制細(xì)胞凋亡，提示mdig具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。
　　3、在A549細(xì)胞中轉(zhuǎn)染mdig siRNA后，與陰性對照組相比，活化的Caspase-8和Caspase-3水平均下降(p＜0.05)，提示md