補(bǔ)肺消積飲對(duì)人肺腺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞增殖、凋亡及MGMT基因甲基化影響的研究.pdf

1、目的:本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察補(bǔ)肺消積飲對(duì)肺癌細(xì)胞株A549的增殖抑制作用和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用，確定補(bǔ)肺消積飲的最適濃度和最適時(shí)間;研究補(bǔ)肺消積飲對(duì)A549細(xì)胞MGMT基因甲基化的影響，嘗試闡述抑制該細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制，為中醫(yī)藥治療腫瘤提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法:1、培養(yǎng)A549細(xì)胞，每2～3天傳代一次，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。2、MTT法探索補(bǔ)肺消積飲抑制A549細(xì)胞生長(zhǎng)活性的濃度和作用時(shí)間:細(xì)胞加入補(bǔ)肺消積飲培養(yǎng)

2、液，設(shè)置800、400、200、100、50、25、12.5、6.25、3.125mg/L共9個(gè)濃度梯度，另設(shè)立陰性對(duì)照組不加藥物，每組4個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)。分別于24、48、72小時(shí)，以MTT法測(cè)定補(bǔ)肺消積飲對(duì)A549細(xì)胞生長(zhǎng)活性的影響。3、AnnexinⅤ/PI流式細(xì)胞分析法檢測(cè)細(xì)胞凋亡:各組細(xì)胞加藥48h經(jīng)處理后于流式細(xì)胞儀(FACS)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。獲得細(xì)胞凋亡數(shù)據(jù)后用ModFitLT軟件進(jìn)行細(xì)胞凋亡相對(duì)定量分析。4、RT-PCR法

3、檢測(cè)MGMT基因表達(dá):分別取經(jīng)過(guò)補(bǔ)肺消積飲各時(shí)相干預(yù)的細(xì)胞，提取出各時(shí)相細(xì)胞的mRNA，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄技術(shù)，合成各時(shí)相細(xì)胞cDNA，通過(guò)設(shè)計(jì)的人MGMT基因的引物，PCR擴(kuò)增出MGMT基因序列，并以GAPDH基因做內(nèi)參，運(yùn)用軟件檢測(cè)出各時(shí)相干預(yù)的細(xì)胞MGMT基因的表達(dá)量。5、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析SPSS18.0軟件分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差表示，計(jì)量資料采用(x)±s表示，多組資料采用方差分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01表示差異有顯

4、著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＞0.05表示差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:1、補(bǔ)肺消積飲抑制肺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞的增殖，呈時(shí)間劑量依賴性。25mg/L補(bǔ)肺消積飲處理A549細(xì)胞48h后，A549細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖出現(xiàn)明顯的抑制作用。
　　 2、AnnexinⅤ/PI法證實(shí)了補(bǔ)肺消積飲可以誘導(dǎo)人肺癌細(xì)胞株A549凋亡。
　　 3、RT-PCR結(jié)果顯示補(bǔ)肺消積飲可降低MGMT甲基化水平，并與一定濃度內(nèi)補(bǔ)肺消積飲的作用濃度和時(shí)間相關(guān)