全反式維甲酸對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞株增殖及環(huán)氧化酶-2表達(dá)的影響.pdf

1、目的：通過體外研究維甲類化合物的衍生物--全反式維甲酸（all-trans retinoic acid，ATRA）對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞株的作用，探討ATRA對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞株增殖及環(huán)氧化酶-2（Cyclooxygenase-2，COX-2）表達(dá)的影響及其可能的機(jī)制。方法：（1）培養(yǎng)肺腺癌A549細(xì)胞：將肺腺癌A549細(xì)胞株接種在25ml培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，以含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，在5％CO2、37℃孵箱進(jìn)行培養(yǎng)。（2）

2、取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期培養(yǎng)的肺腺癌A549細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，按ATRA作用細(xì)胞的時(shí)間分為24小時(shí)，48小時(shí)和72小時(shí)三個(gè)時(shí)間段，每個(gè)時(shí)間段再按藥物濃度分為1×10-7mol/L（第2組），1×10-6mol/L（第3組），1×10-5mol/L（第4組），1×10-4mol/L（第5組）四組藥物濃度組和不加藥的對(duì)照組（第1組）共5組，每組10個(gè)實(shí)驗(yàn)孔。待各實(shí)驗(yàn)濃度的藥物作用細(xì)胞于各實(shí)驗(yàn)時(shí)間段后，用四甲基偶氮唑鹽法（MTT法）進(jìn)行測(cè)定，分別檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組

3、和對(duì)照組細(xì)胞的吸光度值，計(jì)算在各時(shí)間段各實(shí)驗(yàn)濃度藥物對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率。（3）選擇最佳的藥物作用時(shí)間（72小時(shí)）和各實(shí)驗(yàn)藥物濃度，用免疫細(xì)胞化學(xué)S-P（streptavidin-peroxidase）法測(cè)定細(xì)胞漿內(nèi)COX-2的表達(dá)，培養(yǎng)同樣時(shí)間不加藥的細(xì)胞作對(duì)照組，比較實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組細(xì)胞漿內(nèi)COX-2的表達(dá)是否有差異。（4）選擇最佳的藥物作用時(shí)間（72小時(shí)）和各實(shí)驗(yàn)藥物濃度，用酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immunoso

4、rbent assay，ELISA）測(cè)定細(xì)胞上清液中COX-2的含量變化，培養(yǎng)同樣時(shí)間不加藥物的細(xì)胞作對(duì)照組，比較實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組細(xì)胞上清液中COX-2的含量是否有差異。（5）選擇最佳的藥物作用時(shí)間（72小時(shí)）和各實(shí)驗(yàn)藥物濃度，用透射電鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)變化，培養(yǎng)同樣時(shí)間不加藥的細(xì)胞作對(duì)照組，比較實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)是否有差異。結(jié)果：（1）當(dāng)不同實(shí)驗(yàn)濃度的ATRA作用肺腺癌A549細(xì)胞24小時(shí)后：1×10-7mol/L濃度組，1×10-6

5、mol/L濃度組分別與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），表明此兩濃度的ATRA作用細(xì)胞24小時(shí)后對(duì)細(xì)胞無明顯的抑制作用；1×10-5mol/L濃度組，1×10-4mol/L濃度組分別與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明此兩濃度的ATRA對(duì)細(xì)胞有明顯的抑制作用；相鄰各實(shí)驗(yàn)組之間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。綜上，用不同濃度的ATRA作用肺腺癌A549細(xì)胞24小時(shí)后，當(dāng)達(dá)到一定的藥物濃度時(shí)對(duì)細(xì)胞有抑制作

6、用。（2）當(dāng)不同實(shí)驗(yàn)濃度的ATRA作用肺腺癌A549細(xì)胞48小時(shí)后：1×10-7mol/L濃度組與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），表明此濃度的ATRA作用細(xì)胞48小時(shí)后對(duì)細(xì)胞無明顯的抑制作用；1×10-6mol/L濃度組，1×10-5mol/L濃度組和1×10-4mol/L濃度組分別與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明這三個(gè)濃度的ATRA對(duì)細(xì)胞有明顯的抑制作用；相鄰各實(shí)驗(yàn)組之間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0

7、.05）。綜上，用不同濃度的ATRA作用肺腺癌A549細(xì)胞48小時(shí)后，當(dāng)達(dá)到一定的藥物濃度時(shí)對(duì)細(xì)胞有抑制作用，且隨著濃度增大抑制越明顯。（3）當(dāng)不同實(shí)驗(yàn)濃度的ATRA作用肺腺癌A549細(xì)胞72小時(shí)后：1×10-7mol/L濃度組，1×10-6mol/L濃度組，1×10-5mol/L濃度組，和1×10-4mol/L濃度組分別與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明各濃度的ATRA對(duì)細(xì)胞均有抑制作用；相鄰各實(shí)驗(yàn)組之間比較，差異有

8、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。綜上，用不同實(shí)驗(yàn)濃度的ATRA作用肺腺癌A549細(xì)胞72小時(shí)后，隨著實(shí)驗(yàn)組濃度的升高，抑制作用愈加明顯。（4）選擇不同實(shí)驗(yàn)濃度的ATRA作用肺腺癌A549細(xì)胞72小時(shí)后，可見COX-2在細(xì)胞漿里的表達(dá)下降，并隨著實(shí)驗(yàn)組濃度的升高，COX-2表達(dá)下降愈加明顯，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明COX-2可能參與了ATRA對(duì)細(xì)胞抑制的過程；相鄰各實(shí)驗(yàn)組之間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。（

9、5）選擇不同實(shí)驗(yàn)濃度的ATRA作用肺腺癌A549細(xì)胞72小時(shí)后，各實(shí)驗(yàn)組均可見A549細(xì)胞上清液中COX-2的含量下降，并隨著實(shí)驗(yàn)組濃度的升高，COX-2含量下降愈加明顯，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），進(jìn)一步表明COX-2可能參與了ATRA對(duì)細(xì)胞抑制的過程；相鄰各實(shí)驗(yàn)組之間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。（6）選擇不同濃度的ATRA作用肺腺癌A549細(xì)胞72小時(shí)后，透射電鏡下可見各實(shí)驗(yàn)組的肺腺癌A549細(xì)胞表現(xiàn)為