SiRNA下調(diào)bFGF基因?qū)Ψ蜗侔〢549影響的相關(guān)性研究.pdf

1、目的與背景:肺癌是世界上最常見的癌癥，肺癌可分為兩大類:非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)和小細(xì)胞肺癌(SCLC)，NSCLC(Non-small-cell lung cancer，NSCLC)占所有肺癌病例的80％～85％，非小細(xì)胞肺癌已成為全球發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤。肺癌病死率無論男女均占惡性腫瘤病死率的第一位，嚴(yán)重威脅人類健康。近年來，隨著分子生物學(xué)和藥理學(xué)的不斷發(fā)展，NSCLC的綜合治療及個(gè)體化治療已取得明顯進(jìn)步，然而由于腫瘤耐藥

2、的出現(xiàn)，使得絕大部分腫瘤化療后很快出現(xiàn)復(fù)發(fā)或或轉(zhuǎn)移，從而限制了許多化療藥物例如紫杉醇等抗腫瘤藥物在NSCLC治療的臨床應(yīng)用。
　　 bFGF在體內(nèi)分布非常廣泛，其生物學(xué)行為呈多樣性和多效性分布。bFGF主要存在低親和力受體和親和力受體兩類，分別為肝素受體和酪氨酸蛋白激酶受體;不同組織細(xì)胞FGF受體表達(dá)特異性。目前研究證實(shí)在腫瘤細(xì)胞的生長、生存、凋亡和在新生血管的FGFs-FGFRs信號通路的異?；罨嘘P(guān)聯(lián)并參與其過程。研究表明，

3、肺癌患者bFGF血清含量和患者預(yù)后密切相關(guān)，血清含量高者預(yù)后較差。過往研究發(fā)現(xiàn)bFGF參與病理和生理的新生血管的機(jī)制相關(guān)，推測bFGF不僅在肺癌的發(fā)生、發(fā)展、浸潤、轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用，還有機(jī)體的耐藥性有關(guān)。構(gòu)建靶向bFGF的siRNA，以脂質(zhì)體為載體介導(dǎo)bFGF siRNA轉(zhuǎn)染肺腺癌細(xì)胞株A549，利用實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcription-polymerase chain reacti，R

4、T-PCR)檢測bFGF siRNA干擾下調(diào)前后細(xì)胞內(nèi)bFGF的mRNA含量，篩選轉(zhuǎn)染下調(diào)最顯著的siRNA序列;利用蛋白質(zhì)免疫印跡檢測技術(shù)(western blot analysis，Western blot)檢測bFGF siRNA干擾下調(diào)前后肺腺癌A549細(xì)胞內(nèi)bFGF蛋白水平變化。應(yīng)用MTT法即標(biāo)準(zhǔn)比色法檢測bFGF siRNA干擾下調(diào)前后腫瘤細(xì)胞內(nèi)bFGF的表達(dá)水平與紫杉醇藥物敏感性的關(guān)系，為臨床個(gè)體化治療提供理論依據(jù)。

5、>　　 方法:應(yīng)用PUBMED查尋bFGF基因序列，NM_002006.4，采用人工合成siRNA序列，同時(shí)以negative siRNA作為對照，能夠用脂質(zhì)體Lipofectamine2000為載體將bFGF siRNA導(dǎo)入肺腺癌A549細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，對bFGF siRNA干擾下調(diào)前后肺腺癌A549細(xì)胞提取總RNA及總蛋白，應(yīng)用RT-PCR技術(shù)對siRNA干擾下調(diào)前后肺腺癌A549細(xì)胞的bFGF mRNA進(jìn)行定量分析，篩選出轉(zhuǎn)染

6、效率高的siRNA序列。再利用篩選的siRNA序列干擾下調(diào)肺腺癌A549細(xì)胞，步驟同前，Westen-blot法檢測干擾下調(diào)后肺腺癌A549細(xì)胞中bFGF蛋白水平的表達(dá)。MTT比色法檢測干擾下調(diào)前后肺腺癌A549細(xì)胞對紫杉醇藥物敏感性的變化。應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測干擾下調(diào)后肺腺癌A549細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的變化。
　　 結(jié)果:RT-PCR結(jié)果顯示bFGF siRNA干擾下調(diào)后肺腺癌A549后bFGF基因水平表達(dá)降低，其中bFGF s

7、iRNA-2基因序列轉(zhuǎn)染下調(diào)效率最高;Western blot檢測結(jié)果顯示siRNA-1干擾下調(diào)肺腺癌A549細(xì)胞后其bFGF蛋白表達(dá)水平較干擾下調(diào)前顯著降低。MTT比色法檢測干擾下調(diào)前后肺腺癌A549細(xì)胞對紫杉醇藥物敏感性，結(jié)果顯示干擾下調(diào)前后細(xì)胞對紫杉醇的抑制率較對照組顯著增高(P＜0.05)。流式細(xì)胞儀細(xì)胞凋亡檢測顯示:bFGF siRNA+紫杉醇組凋亡細(xì)胞比例較controlsiRNA組、control siRNA+紫杉醇組、b