Rad51基因沉默對人肺腺癌A549細(xì)胞體內(nèi)外增殖能力的影響.pdf

1、目的：
　　本課題通過慢病毒包裝siRNA干擾抑制人肺腺癌A549細(xì)胞 Rad51基因的表達(dá)，研究感染前后 A549細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期以及裸鼠移植瘤早期生長的變化，探討 Rad51基因在肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用，以期為 NSCLC的靶向治療提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及理論依據(jù)。
　　方法：
　　常規(guī)培養(yǎng)人肺腺癌A549細(xì)胞株,針對Rad51基因序列,選取并設(shè)計(jì)RNA干擾靶點(diǎn),構(gòu)建針對Rad51基因的干擾慢病毒。實(shí)驗(yàn)分為三組：Normal

2、組：用含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)人肺腺癌A549細(xì)胞；Lenti-NC組：感染了空載體慢病毒以后的肺腺癌A549細(xì)胞；Lenti-Rad51si組：感染了Rad51siRNA慢病毒的肺腺癌A549細(xì)胞。通過熒光定量PCR（Q-PCR）測定感染前后 A549細(xì)胞中的Rad51mRNA水平；Western Blot檢測感染前后A549細(xì)胞中Rad51蛋白的表達(dá)；克隆形成實(shí)驗(yàn)研究感染前后 A549細(xì)胞的增殖能力；MTT法檢測感染前后

3、 A549細(xì)胞的增殖活性；FCM法分析感染前后 A549細(xì)胞的細(xì)胞周期情況；裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)觀察感染前后 A549細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的生長狀況。
　　結(jié)果：
　　1.由上海吉凱公司構(gòu)建Rad51 siRNA慢病毒質(zhì)粒，包裝后的病毒Lenti-Rad51滴度為2×108TU/ml，空載體病毒 Lenti-NC滴度為8×108 TU/ml。
　　2.Rad51 siRNA慢病毒和陰性對照慢病毒感染A549細(xì)胞后均能獲得較高的感染

4、效率；
　　3. Rad51 siRNA慢病毒感染A549細(xì)胞48小時(shí)后，應(yīng)用QuantitativeRT-PCR和Western Blot技術(shù)檢測，結(jié)果顯示該組細(xì)胞株中Rad51 mRNA和蛋白表達(dá)水平均下調(diào)；
　　4. Rad51基因沉默降低A549細(xì)胞的克隆形成能力；
　　5. MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明下調(diào)的Rad51降低了A549細(xì)胞的活性；
　　6. FCM法結(jié)果證實(shí)Rad51表達(dá)量下調(diào)能將A549細(xì)胞阻滯在