苦參總堿對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞的增殖抑制作用的研究.pdf

1、目的：探究中藥苦參中總生物堿對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞株增殖、細(xì)胞周期等方面的影響及對(duì)其miRNA表達(dá)的改變。
　　方法：A549細(xì)胞培養(yǎng)于含有10％滅活血清的DMEM培養(yǎng)液中，在37℃，5%CO2濕度飽和的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。用濃度為0.5mg/ml、1.0mg/ml、1.5mg/ml、2.0mg/ml及2.5mg/ml的苦參總堿分別作用于細(xì)胞24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)后，以MTT比色法檢測(cè)苦參總堿對(duì)A549細(xì)胞增殖的抑制作用；濃度

2、為0.5、1.0、1.5mg/ml苦參總堿分別作用于 A549細(xì)胞72小時(shí)后，倒置相差顯微鏡觀察 A549細(xì)胞的一般形態(tài)學(xué)變化；Hoechst33258染色后檢測(cè)細(xì)胞凋亡；用流式細(xì)胞術(shù)（FCM）測(cè)定細(xì)胞周期，通過蛋白免疫印跡法檢測(cè)Fas蛋白及VEGF蛋白表達(dá)水平的變化；抽取并富集空白組與1.0mg/ml苦參總堿作用72小時(shí)后的實(shí)驗(yàn)組的miRNA，制作miRNA基因芯片分析實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間miRNA表達(dá)譜的差異。
　　結(jié)果：濃度為

3、0.5mg/ml、1.0mg/ml、1.5mg/ml、2.0mg/ml及2.5mg/ml的苦參總堿分別作用A549細(xì)胞24小時(shí)后，其抑制率分別為（7.46±0.72）%、（17.68±0.93）%、（25.17±1.13）%、（41.90±3.65）%、（49.05±4.72）%；作用于細(xì)胞48小時(shí)后，其抑制率分別為（14.02±1.23）%、（40.53±1.06）%、（63.28±1.42）%、（75.46±1.13）%、（78.6

4、0±3.31）%，作用于細(xì)胞72小時(shí)后，其抑制率分別為（16.77±1.11）%、（46.87±1.02）%、（74.80±1.12）%、（84.13±1.46）%、（85.01±3.46）%，各實(shí)驗(yàn)組與空白組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），各實(shí)驗(yàn)組之間相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。濃度為0.5mg/ml、1.0mg/ml及1.5 mg/ml的苦參總堿分別作用細(xì)胞72h后，G0/G1期細(xì)胞百分比分別為（64.43±0.73）%、（

5、76.00±0.60）%、（79.13±0.72）%，S期細(xì)胞的百分比為（26.50±1.25）%、（16.30±0.69）%、（14.10±0.55）%,G2期細(xì)胞的百分比為（8.10±0.55）%、（7.61±0.68）%、（6.78±0.50）%，各實(shí)驗(yàn)組與空白組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。用濃度為0.5mg/ml、1.0mg/ml及1.5 mg/ml的苦參總堿分別作用細(xì)胞72小時(shí)后，Western blotting結(jié)果顯示

6、，苦參總堿使Fas蛋白的表達(dá)水平提高，VEGF蛋白表達(dá)水平降低，且變化均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），F(xiàn)as蛋白灰度值分別為127.37±2.32、206.98±1.17和343.00±2.13，VEGF蛋白灰度值分別為408.15±1.13、256.88±1.65和154.35±1.01。miRNA基因芯片對(duì)770個(gè)miRNA表達(dá)情況的檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組對(duì)比，實(shí)驗(yàn)組發(fā)生改變的miRNA有64個(gè)，其中上調(diào)的有59個(gè)，下調(diào)的有5個(gè)