人肺腺癌細(xì)胞A549中DEK的作用機(jī)制研究.pdf

1、目的:DEK是廣泛存在于細(xì)胞核內(nèi)高度保守的可磷酸化癌蛋白，在人類許多惡性腫瘤中均出現(xiàn)過表達(dá)，表現(xiàn)出與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。DEK可通過改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)，修復(fù)DNA，參與mRNA剪接與信號(hào)通路，或作為轉(zhuǎn)錄因子等途徑調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、遷移、衰老等，與腫瘤細(xì)胞的形成有著重要的關(guān)系。目前關(guān)于DEK促進(jìn)腫瘤發(fā)展的研究越來越多，然而關(guān)于DEK與肺癌的關(guān)系以及DEK在肺癌中的作用機(jī)制尚未有完善的研究成果。前期研究結(jié)果顯示，DEK蛋白在人肺癌

2、腫瘤組織中的表達(dá)量明顯高于正常組織，提示DEK可能在肺癌的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用，因此本研究在前期工作的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步在細(xì)胞層面上研究DEK沉默對(duì)肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的影響，并深入探討DEK在肺癌中的作用機(jī)制，為肺癌的治療提供新的途徑與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:本實(shí)驗(yàn)通過實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR與Western Blotting檢測(cè)6種肺癌細(xì)胞系中DEK表達(dá)水平差異，從中篩選出內(nèi)源性高水平表達(dá)DEK的細(xì)胞，并通過RNAi慢病毒載體構(gòu)建DEK

3、沉默的A549細(xì)胞，通過RNA-Seq檢測(cè)由DEK沉默誘導(dǎo)的差異表達(dá)基因，再通過GO分析與Pathway分析評(píng)估差異表達(dá)基因與肺癌的關(guān)系，最后在細(xì)胞層面上驗(yàn)證分析的準(zhǔn)確性，通過MTT法檢測(cè)DEK沉默對(duì)A549細(xì)胞增殖能力的影響，PI染色法檢測(cè)DEK沉默對(duì)A549細(xì)胞周期的影響，AnnexinⅤ-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)DEK沉默對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響，此外，通過實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR與Western Blotting檢測(cè)

4、IGFBP3/IGF-1R/AKT通路相關(guān)基因的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:通過GO分析與Pathway分析評(píng)估DEK沉默的A549細(xì)胞中差異表達(dá)基因與肺癌的關(guān)系，結(jié)果顯示DEK與細(xì)胞生長(zhǎng)和死亡密切相關(guān)。進(jìn)一步，使用DEKsiRNA轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，檢測(cè)DEK沉默對(duì)A549細(xì)胞功能的影響，結(jié)果顯示DEK沉默可抑制A549細(xì)胞的增殖，引起A549細(xì)胞周期在G1期發(fā)生阻滯，而且能夠顯著促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。最后檢測(cè)IGFBP3/IGF-1R/AK