LITAF基因?qū)θ朔伟〢549細(xì)胞體外抑制作用.pdf

1、目的:
　　目前脂多糖誘導(dǎo)的甲型腫瘤壞死因子( lipopolyaccharide-induced tumor necrosis factor alpha factor, LITAF)與腫瘤之間的關(guān)系剛引起人們的注意,在人體內(nèi)它可能發(fā)揮著腫瘤抑制功能。本研究通過構(gòu)建穩(wěn)定的細(xì)胞株,在體外研究LITAF對腫瘤的抑制作用,并探索其可能的腫瘤抑制機制,為進(jìn)一步研究提供實驗依據(jù)。
　　方法:
　　1.制備含pSuperRetro

2、-LITAF-shRNA/shRNA-Control重組質(zhì)粒的包裝病毒,然后感染肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549,puromycin篩選獲得穩(wěn)定細(xì)胞株A549-LITAF-shRNA與A549-shRNA-C。
　　2.通過MTT、細(xì)胞軟瓊脂非貼壁性生長(Anchorage independent growth)、細(xì)胞劃痕(Scratch wound healing)等試驗比較這兩種細(xì)胞的生物學(xué)行為,以了解LITAF對于腫瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)行為改

3、變的影響。
　　3.通過microarray分析A549-LITAF-shRNA與A549-shRNA-C兩個細(xì)胞中miRNA的表達(dá)差異,找尋受 LITAF調(diào)控的miRNA。應(yīng)用靶基因預(yù)測軟件(TargetScan等)預(yù)測并通過Western Blot及qPCR驗證miRNA介導(dǎo),受LITAF調(diào)控的下游基因。
　　結(jié)果:
　　1.Western Blot結(jié)果顯示,篩選出的A549-LITAF-shRNA單克隆細(xì)胞株中的

4、LITAF蛋白表達(dá)量(LITAF/β-actin,0.09)與A549-shRNA-C細(xì)胞克隆株(LITAF/β-actin,0.45)比較,干擾組中LITAF的表達(dá)量明顯低于對照組,且表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),提示細(xì)胞株構(gòu)建成功。
　　2.MTT結(jié)果表明A549-LITAF-shRNA干擾組與A549-shRNA-C(scrambled)對照組相比,A549-LITAF-shRNA組的增值能力明顯增強(P<0.01)

5、;細(xì)胞軟瓊脂非貼壁性生長試驗結(jié)果顯示LITAF干擾表達(dá)的細(xì)胞株的集落形成能力明顯強于對照組;而細(xì)胞劃痕實驗結(jié)果提示LITAF被干擾表達(dá)后,A549肺癌細(xì)胞的遷移能力有所增強。通過以上研究我們可以得出,LITAF的表達(dá)能夠抑制A549肺癌細(xì)胞的增殖與遷移,而LITAF表達(dá)缺失會加重腫瘤細(xì)胞惡性程度。
　　3.通過microarray技術(shù)比較發(fā)現(xiàn),miRNA-15a/128/192/194在A549-LITAF-shRNA細(xì)胞株中的表

6、達(dá)量較對照細(xì)胞株明顯下降,隨后的熒光定量PCR結(jié)果也證實了LITAF與這四個miRNA的關(guān)聯(lián)性。通過靶基因預(yù)測軟件定位,并查閱文獻(xiàn),本研究發(fā)現(xiàn)癌基因Bmi-1可能受LITAF負(fù)調(diào)控,通過蛋白及mRNA表達(dá)情況檢測顯示與對照組相比,LITAF表達(dá)缺失的情況下,Bmi-1的表達(dá)量明顯升高(P<0.05)。因此,LITAF能夠抑制癌基因Bmi-1的表達(dá)可能為LITAF發(fā)揮腫瘤抑制功能的機制之一。
　　結(jié)論:
　　LITAF能夠發(fā)揮