靶向沉默MT1-MMP基因?qū)Ψ蜗侔〢549細胞MT1-MMP表達的影響.pdf

1、目的:利用基因轉(zhuǎn)染和RNA干擾技術(shù),化學合成靶向人類膜型基質(zhì)金屬蛋白酶-1(MT1-MMP)的小片段RNA,探討siRNA-MT1-MMP對人類A549細胞MT1-MMP基因mRNA及蛋白表達的影響。
　　方法:根據(jù)人類MT1-MMPmRNA序列(NM_4323)設計并合成三個不同的siRNA寡核苷酸片段序列。實驗分為五組,空白對照組,陰性對照組(加入siRNA-NC),RNAi組(siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3)

2、。利用核酸轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染A549細胞后通過流式細胞儀檢測最佳轉(zhuǎn)染比例(LipofectamineTM2000∶siRNA)及轉(zhuǎn)染效率,分別于轉(zhuǎn)染后24、48h采用qRT-PCR方法檢測MT1-MMPmRNA水平,用Westernblot方法檢測MT1-MMP蛋白質(zhì)表達水平。
　　結(jié)果:設計合成的siRNA能成功轉(zhuǎn)染肺腺癌A549細胞中,流式細胞儀確定最佳轉(zhuǎn)染比例為(1∶2),瞬時轉(zhuǎn)染A54

3、9細胞12小時后的轉(zhuǎn)染效率高達80.18％。在轉(zhuǎn)染24h、48h后,收集各組細胞,實時熒光定量PCR結(jié)果顯示,各干擾組與空白組比較時MT1-MMP基因表達量明顯下調(diào),其中干擾組(siRNA-3)48小時的有效抑制率可達到90%,蛋白質(zhì)水平明顯下調(diào)。陰性對照組和空白組中MT1-MMP的表達量無明顯差異。
　　結(jié)論:本實驗成功的利用RNAi技術(shù),有效地抑制肺腺癌A549細胞中MT1-MMP基因的表達,為進一步探討MT1-MMP在肺癌轉(zhuǎn)