基于MT1-MMP抗乳腺癌先導(dǎo)藥物篩選與研究.pdf

1、乳腺癌是一種高度異質(zhì)性的惡性腫瘤，其發(fā)病率逐漸上升，且是女性癌癥死亡的第二殺手。尋找有效的治療靶點(diǎn)和適宜的治療藥物，對(duì)不同患者采取個(gè)體化綜合治療，已成為研究熱點(diǎn)。在眾多的腫瘤靶蛋白中，膜型Ⅰ基質(zhì)金屬蛋白酶(Membrane type-1matrix metalloproteinase，MT1-MMP)參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、浸潤以及血管生成等多種過程，是一個(gè)理想的藥物靶點(diǎn)。中醫(yī)中藥有著獨(dú)特的療效，廣泛用于治療乳腺癌。分子靶向和中藥治療可望為

2、乳腺癌治療帶來新的前景。
　　本文首先通過計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)進(jìn)行靶向MT1-MMP的反義肽篩選和研究，采用分子對(duì)接、分子動(dòng)力學(xué)模擬、體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)等方法，確定反義肽對(duì)MT1-MMP和乳腺癌細(xì)胞的靶向性;其次，以MT1-MMP為橋梁，探討藥用植物提取液（試劑2號(hào)）對(duì)MT1-MMP陰、陽性兩種乳腺癌細(xì)胞株的藥效作用與分子作用機(jī)制，通過MTT、AO-EB雙染、DNA Ladder、流式細(xì)胞、熒光定量PCR(Fluorescence Qua

3、ntitative PCR，F(xiàn)Q-PCR)、Western blot等方法，確定試劑2號(hào)的藥效作用、作用靶點(diǎn)和細(xì)胞死亡途徑。
　　多序列比對(duì)確定了位于MT1-MMP環(huán)區(qū)的特異序列AYIREGHE（簡稱MT1-loop），并構(gòu)建1536條反義肽。通過兩輪虛擬篩選，獲得了分值較好的5條反義肽。將五條反義肽與其他MMPs成員進(jìn)行分子對(duì)接，發(fā)現(xiàn)反義肽FVTFPYIR特異性更好;隨后分子動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)果顯示，F(xiàn)VTFPYIR可能影響MT1-M

4、MP的穩(wěn)定性。在以上的基礎(chǔ)上，合成評(píng)價(jià)最優(yōu)的反義肽FVTFPYIR進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該肽能夠?qū)Ρ磉_(dá)MT1-MMP的乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231具有較好的抑制作用，同時(shí)又有特異親和力。
　　通過MTT法和形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，試劑2號(hào)能夠顯著抑制乳腺癌MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞的活力，作用24 h的IC50分別為3.45％和2.84％，作用48 h的IC50分別為2.36％和2.32％，形態(tài)上也發(fā)生明顯改變，具有時(shí)間-劑量依賴關(guān)

5、系。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步通過瓊脂糖凝膠電泳、AO-EB雙染和流式細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)3％試劑2號(hào)能夠誘導(dǎo)乳腺細(xì)胞凋亡，同時(shí)非凋亡途徑也參與了細(xì)胞死亡。隨后，F(xiàn)Q-PCR結(jié)果表明，在MDA-MB-231細(xì)胞中，3％試劑2號(hào)與陽性對(duì)照DOX類似，能夠提高M(jìn)MP2、MMP9、MT1-MMP、caspase3和caspase8基因的相對(duì)表達(dá)量;在MCF-7細(xì)胞中，3％試劑2號(hào)與DOX可提高M(jìn)MP2、MMP9、caspase8、caspase9、p53和bc

6、l-2基因相對(duì)表達(dá)量，下調(diào)caspase3基因。在蛋白水平上，在MDA-MB-231細(xì)胞中，試劑2號(hào)上調(diào)MT1-MMP和p53蛋白，下調(diào)caspase3，對(duì)bcl-2表達(dá)無影響;在MCF-7細(xì)胞中，上調(diào)caspase3，下調(diào)bcl-2，p53蛋白24 h表達(dá)下降，48 h表達(dá)增加。由此可以看出，試劑2號(hào)對(duì)兩株細(xì)胞作用方式不盡相同。
　　主要結(jié)論:靶向MT1-MMP反義肽可望成為抗腫瘤多肽藥物研發(fā)的一條有用途徑，藥用植物提取液（試劑