UCH-L1在乳腺癌中的表達(dá)及其與乳腺癌轉(zhuǎn)移關(guān)系的研究.pdf

1、泛素羧基末端水解酶L1（UCH-L1），又叫蛋白基因產(chǎn)物9.5（PGP9.5），屬于泛素羧基末端水解酶家族，參與泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解途徑，其主要作用是當(dāng)泛素化的底物附著到蛋白酶體后，UCH-L1水解泛素和底物蛋白質(zhì)間的鏈，然后底物進(jìn)入蛋白酶體被降解，而多聚泛素被切割為單體重新參與泛素蛋白酶體的循環(huán)，具有泛素連接酶活性及泛素水解酶活性。早期關(guān)于UCH-L1的研究集中于它對神經(jīng)組織以及性別發(fā)育的作用，尤其在帕金森病的研究中較多。近年研究表明

2、，UCH-L1的表達(dá)有嚴(yán)格的時(shí)間和空間特異性，異常表達(dá)常常與細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化和腫瘤的發(fā)生有關(guān)。UCH-L1在多種腫瘤中高表達(dá)，在部分腫瘤中其表達(dá)與腫瘤浸潤深度、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。
　　 絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）是細(xì)胞內(nèi)的主要信息傳遞系統(tǒng)。p38是MAPK家族重要成員之一。它是一種廣泛存在于細(xì)胞質(zhì)中的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可將細(xì)胞外信息傳遞至細(xì)胞核中，

3、從而介導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生各種反應(yīng)。p38通過磷酸化轉(zhuǎn)錄因子引起多種相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，調(diào)控活性物質(zhì)的表達(dá)。p38MAPK信號通路參與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移以及腫瘤細(xì)胞生長和增殖。
　　 經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，UCH-L1與p38存在一定關(guān)系。非小細(xì)胞肺癌中用RNA干擾抑制UCH-L1的表達(dá)，能夠抑制非小細(xì)胞肺癌體內(nèi)外的轉(zhuǎn)移，抑制p38的激活。在乳腺癌中UCH-L1的表達(dá)是否與腫瘤的分化程度以及侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)，UCH-L1與p38之間調(diào)控關(guān)系如何，目前報(bào)道較少。

4、
　　 材料和方法：
　　 一、材料
　　 （一）臨床資料
　　 收集80例乳腺癌組織，取自于中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院2002年1月至2008年5月手術(shù)切除標(biāo)本。所有患者術(shù)前未經(jīng)任何治療。80例乳腺癌組織均為乳腺浸潤性導(dǎo)管癌（IDC），按TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ-Ⅱ期48例，Ⅲ-Ⅳ期32例。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移33例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移47例。收集50例外科手術(shù)切除新鮮乳腺組織標(biāo)本，標(biāo)本取出后立即置-70℃冰凍保存。其中30

5、例為IDC，（有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移14例），20例為乳腺纖維腺瘤。
　　 （二）細(xì)胞系
　　 一種乳腺正常上皮細(xì)胞系MCF-10A和兩種乳腺癌細(xì)胞系（MCF-7為低侵襲低轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞系、MDA-MB-435s為高侵襲高轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞系）原購自北京協(xié)和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞中心，本實(shí)驗(yàn)由已有的細(xì)胞復(fù)蘇而得。
　　 （三）主要試劑
　　 鼠抗人UCH-L1單克隆抗體（sc-58593）購自SANTA CRUZ公司，鼠抗人p-p38

6、單克隆抗體（＃9216）購自Cell signaling公司。UCH-L1抑制劑（＃662086）購自Merck公司。Transwell小室（孔徑8um）購自Coming公司。
　　 二、方法
　　 （一）免疫組織化學(xué)技術(shù)
　　 80例標(biāo)本經(jīng)10％中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，4μm厚連續(xù)切片，采用鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶法（Streptavidin-peroxidase，S-P）按說明書行免疫組化染色。

7、UCH-L1稀釋比例為1:150，p-p38稀釋比例為1:200，以PBS代替一抗作陰性對照，用已知陽性乳腺癌切片作陽性對照。
　　 （二）Western blot技術(shù)
　　 總蛋白從組織、生長到對數(shù)期收集的細(xì)胞及不同濃度的UCH-L1抑制劑處理24小時(shí)后的MDA-MB-435s細(xì)胞中提取。用Bradford法測定蛋白濃度。取等量蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE和轉(zhuǎn)印，分別孵育一抗（UCH-L11:400，p-p381:400

8、稀釋）4℃過夜，相應(yīng)二抗（1:4000）37℃孵育，ECL 發(fā)光，拍照。用表達(dá)陽性的PVDF膜剝脫后重新孵育β-actin抗體作為內(nèi)參。
　　 （三）Transwell實(shí)驗(yàn)
　　 上室加入1:6Matrigel膠制成的人工基底膜后接種總體積200ul的MDA-MB-435s細(xì)胞，并加入終濃度分別為0u mol、5u mol、10u mol、20u mol的UCH-L1抑制劑。每個(gè)藥物濃度做3復(fù)孔，37℃培養(yǎng)24h后觀察。

9、擦掉基底膜上室面的細(xì)胞，下室細(xì)胞固定后Giemsa染色。400×光鏡下隨機(jī)選擇30個(gè)視野計(jì)數(shù)，取其平均數(shù)為穿膜細(xì)胞數(shù)。
　　 三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件行數(shù)據(jù)處理：采用x2檢驗(yàn)（不滿條件時(shí)用Fisher確切概率法）分析各組計(jì)數(shù)資料，采用Spearman等級相關(guān)分析UCH-L1蛋白與p-p38蛋白表達(dá)的關(guān)系，采用t檢驗(yàn)分析Western Blot圖像灰度值，transwell穿膜細(xì)胞數(shù)，用LSD-t

10、檢驗(yàn)對各樣本均數(shù)行兩兩比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 一、UCH-L1、p-p38在乳腺癌組織中的表達(dá)及其同臨床病理參數(shù)的關(guān)系
　　 在80例IDC石蠟標(biāo)本中，UCH-L1陽性表達(dá)42例（52.5％），定位于細(xì)胞漿。p-p38陽性表達(dá)46例（57.5％），主要定位于細(xì)胞核，少量定位于細(xì)胞漿。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，UCH-L1蛋白表達(dá)和p-p38蛋白表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.397，P=0.000

11、）。兩者表達(dá)水平均與IDC的TNM分期（P=0.017，P=0.010）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況（P=0.033，P=0.021）相關(guān)，UCH-L1的表達(dá)與組織學(xué)分級相關(guān)（P=0.032），而p-p38的表達(dá)與組織學(xué)分級無關(guān)（P=0.794），二者與患者年齡（P=0.296，P=0.585），腫瘤大小（P=0.300，P=0.161）無明顯相關(guān)性。
　　 在新鮮乳腺組織中，UCH-L1、p-p38在IDC中的表達(dá)高于乳腺纖維腺瘤組（P=

12、0.012，P=0.001），兩者的表達(dá)水平在Ⅲ-Ⅳ期IDC中高于Ⅰ-Ⅱ期（P=0.014，P=0.002）；在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌中高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者（P=0.016，P=0.001）；UCH-L1的表達(dá)與組織學(xué)分級有關(guān)（P=0.038），而p-p38的表達(dá)與組織學(xué)分級無關(guān)（P=0.130），二者的表達(dá)均與患者的年齡、腫瘤大小無明顯相關(guān)性（P=0.753，P=0.539；P=0.723，P=0.765）。
　　 二、UCH-

13、L1、p-p38在乳腺細(xì)胞系中的表達(dá)
　　 Western blot檢測，乳腺上皮細(xì)胞系MCF-10A和乳腺癌細(xì)胞系MCF-7，MDA-MB-435s中兩種蛋白表達(dá)水平呈遞增趨勢。
　　 三、UCH-L1抑制劑作用MDA-MB-435s細(xì)胞系24h后觀察各指標(biāo)改變
　　 UCH-L1抑制劑可以濃度依賴性地下調(diào)MDA-MB-435s細(xì)胞系中p-p38蛋白表達(dá)水平，并能抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移潛能（P均<0.05）。