針對(duì)乳腺癌抗轉(zhuǎn)移靶向?qū)嶒?yàn)性研究.pdf

1、第一部分，針對(duì)miRNA-10b海綿抗乳腺癌實(shí)驗(yàn)性研究
　　[目的]：
　　1.嘗試針對(duì)miRNA-10b設(shè)計(jì)Sponge。
　　2.明確miRNA-10b Sponge在乳腺癌（高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株MDA-MB-231和低轉(zhuǎn)移MCF-7）中，對(duì)miRNA-10b表達(dá)水平及靶蛋白HOXD-10表達(dá)的影響，以確定抗miRNA-10b Spong發(fā)揮作用的機(jī)制。
　　3.研究miRNA-10 Sponge對(duì)MDA-MB-23

2、1和MCF-7增殖和克隆形成能力的影響。
　　4.觀察miRNA-10b Sponge對(duì)高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株MDA-MB-231侵襲遷移能力的影響。
　　[方法]：
　　1.miRNA-10b Sponge和miRNA-10b過表達(dá)載體的構(gòu)建:miRNA-10b Sponge的根據(jù)文獻(xiàn)設(shè)計(jì)原則，及結(jié)合miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.mirbase.org）所提供的序列信息，交由公司進(jìn)行設(shè)計(jì)合成。
　　2.脂質(zhì)

3、體轉(zhuǎn)染技術(shù):脂質(zhì)體Lipofectamine2000介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù)，將miRNA-10b Sponge載體和miRNA-10b過表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)入乳腺癌細(xì)胞MCF-7和MDA-MB-231中，并用Real-time PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)染后前后miRNA-10b的表達(dá)量。
　　3.CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖:應(yīng)用CCK-8試劑盒檢測(cè)轉(zhuǎn)染miRNA-10bSponge載體和miRNA-10b過表達(dá)載體后的乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和MC

4、F-7的存活率，分析兩株乳腺癌細(xì)胞增殖能力的改變。
　　4.細(xì)胞傷口愈合實(shí)驗(yàn):瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miRNA-10b Sponge載體和miRNA-10b過表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)入乳腺癌細(xì)胞MCF-7和MDA-MB-231后，在單細(xì)胞層的中間劃“十”，在不同的時(shí)間點(diǎn)測(cè)量劃痕寬度，分析處理因素對(duì)乳腺癌遷移細(xì)胞遷移能力的影響。
　　5.細(xì)胞侵襲能力的檢測(cè):在miRNA-10b Sponge處理和miRNA-10b過表達(dá)的狀態(tài)下，用Transwell

5、實(shí)驗(yàn)分析其對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲活性的影響。
　　6.Western Bloting:用于檢測(cè)轉(zhuǎn)染了miRNA-10b Sponge和miRNA-10b過表達(dá)不同質(zhì)粒載體之后，miRNA-10b靶基因HOXD-10蛋白的表達(dá)水平的變化。
　　[結(jié)果]：
　　1.在MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞中，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miRNA-10b Sponge對(duì)miRNA-10a表達(dá)的影響。
　　(1)在MDA-M

6、B-231中，與miRNA-10bNC組比較，轉(zhuǎn)染miRNA-10b Sponge組的miRNA-10a表達(dá)水平至降低對(duì)照組的34％，且P＜0.05。
　　(2)在MCF-7中，與miRNA-10bNC組比較，轉(zhuǎn)染miRNA-10b Sponge組的miRNA-10a表達(dá)水平至降低對(duì)照組的19.2％，且P＜0.05。
　　2.在MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞中，miRNA-10b及HOXD-10蛋白、mRNA的表達(dá)水平

7、差異。
　　(1)與MCF-7比，MDA-MB-231中miRNA-10b表達(dá)水平是其1.23倍。
　　(2)與MCF-7比，MDA-MB-231中HOXD-10蛋白灰度值是其67.6％，HOXD-10 mRNA是其2.23倍，且P＜0.05。
　　3.在MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞中，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miRNA-10b Sponge及miRNA-10b后對(duì)miRNA-10b及HOXD-10蛋白、HOXD-10 mRN

8、A的表達(dá)水平影響。
　　(1)在MDA-MB-231細(xì)胞中，與miRNA-10bNC組比較，miRNA-10b Sponge組miRNA-10b表達(dá)量下降了50％，HOXD-10蛋白、HOXD-10mRNA分別上調(diào)至其1.3倍、16.9倍;miRNA-10b組miRNA-10b表達(dá)量上調(diào)至其8.1倍，HOXD-10蛋白、HOXD-10 mRNA表達(dá)量分別下調(diào)51.3％，4.5％，且P＜0.05。
　　(2)在MCF-7細(xì)胞中

9、，與miRNA-10b NC組比較，miRNA-10b Sponge組miRNA-10b、HOXD-10蛋白、HOXD-10mRNA表達(dá)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;miRNA-10b組miRNA-10b表達(dá)量上調(diào)至其17倍，HOXD-10蛋白、HOXD-10mRNA表達(dá)量分別20.2％，16.8％，且P＜0.05。
　　4.在MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞中，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miRNA-10b Sponge及miRNA-10b后對(duì)增殖、克隆形成

10、能力的影響。
　　(1)在MDA-MB-231細(xì)胞中，miRNA-10b NC組比較，miRNA-10b Sponge組72h時(shí)存活率下調(diào)78.8％，miRNA-10b組存活率上調(diào)至其1.2倍，且P＜0.05;在MCF-7細(xì)胞中，miRNA-10b Sponge組和miRNA-10b組對(duì)細(xì)胞存活率無明顯影響。
　　(2)在MDA-MB-231細(xì)胞中，miRNA-10b NC組比較，miRNA-10b Sponge組克隆形成率

11、下降42.8％; miRNA-10b組克隆形成率是其1.5倍，且P＜0.05;在MCF-7細(xì)胞中miRNA-10b Sponge組和miRNA-10b組對(duì)細(xì)胞克隆形成率無明顯影響。
　　5.在MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞中，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miRNA-10b Sponge及miRNA-10b后對(duì)侵襲，遷移形成能力的影響
　　(1)在MDA-MB-231細(xì)胞中，miRNA-10bNC組比較，miRNA-10b Sponge組侵

12、襲細(xì)胞數(shù)下調(diào)了61.2％，miRNA-10b組侵襲細(xì)胞數(shù)上調(diào)至其1.84倍，且P＜0.05。
　　(2)在MDA-MB-231細(xì)胞中，miRNA-10b NC組比較，24h時(shí)miRNA-10bSponge組愈合面積無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，miRNA-10b組愈合面積上調(diào)至其1.3倍;48h時(shí)，miRNA-10b Sponge組愈合面積下調(diào)了68.8％，miRNA-10b組愈合面積上調(diào)至其1.5倍，且P＜0.05。
　　(3)在MCF-

13、7細(xì)胞中，miRNA-10bNC組比較，24h時(shí)miRNA-10b Sponge組愈合面積無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，miRNA-10b組愈合面積上調(diào)至其2.7倍;48h時(shí)，miRNA-10b Sponge組愈合面積下降了56.8％，miRNA-10b組愈合面積上調(diào)至其1.6倍。
　　[結(jié)論]：
　　1.miRNA-10b Sponge可抑制MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞中miRNA-10a的表達(dá)，miRNA-10a與miRNA-1

14、0b表達(dá)存在交叉反應(yīng)。
　　2.miRNA-10b在高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系MDA-MB-231中高表達(dá)，在低轉(zhuǎn)移細(xì)胞系MCF-7中低表達(dá)。
　　3.miRNA-10b Sponge真核表達(dá)載體可有效的抑制MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞中miRNA-10b的表達(dá)，提高HOXD-10的蛋白及mRNA表達(dá)水平，而對(duì)MCF-7細(xì)胞中HOXD-10的蛋白及mRNA水平無影響。
　　4.miRNA-10b Sponge抑制MDA-MB

15、-231細(xì)胞的克隆增殖能力。
　　5.miRNA-10b Sponge可明顯的降低MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞的遷移能力。
　　第二部分，針對(duì)CXCR4融合多肽抗腫瘤轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)性動(dòng)物治療研究
　　[目的]：
　　1.分析融合多肽TAT-DV1-BH3對(duì)荷瘤裸鼠腫瘤生長(zhǎng)體積以及腫瘤重量是否具有抑制作用。
　　2.明確融合多肽TAT-DV1-BH3在荷瘤裸鼠體內(nèi)分布是否具有靶向性。
　　3.觀察融合

16、多肽TAT-DV1-BH3是否對(duì)荷瘤裸鼠異位移植瘤的遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移具有抑制作用。
　　[方法]：
　　1.四組裸鼠分別給予PBS、DV1-BH3、TAT-DV1和TAT-DV1-BH3治療，從給予裸鼠多肽治療的第一天開始，每隔一天測(cè)量一次腫瘤的大小并計(jì)算體積，第23天后，處死裸鼠，剝離腫瘤，稱量腫瘤質(zhì)量，分析融合多肽TAT-DV1-BH3荷瘤裸鼠腫瘤體積以及腫瘤質(zhì)量是否具有抑制作用。
　　2.四組裸鼠分別給予PBS、DV

17、1-BH3、TAT-DV1和TAT-DV1-BH3，利用小動(dòng)物活體成像技術(shù)觀察多肽在荷瘤裸鼠體內(nèi)分布是否具有靶向性。
　　3.將治療結(jié)束的四組荷瘤裸鼠處死，分別取出每組的肝臟，固定、制片、HE染色，鏡下觀察融合多肽TAT-DV1-BH3是否對(duì)荷瘤裸鼠異位移植瘤的遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移具有抑制作用。
　　[結(jié)果]：
　　1.在23天實(shí)驗(yàn)過程中，從第一次給藥的15天后，除了第17天，其余的各天TAT-DV1-BH3治療組與其他三組進(jìn)

18、行比較，腫瘤的體積較小，P＜0.05，差異有顯著性;在治療后的第23天后處死裸鼠，取出腫瘤稱重，TAT-DV1-BH3治療組與對(duì)照組比，體重明顯小于其他三組，P＜0.05，融合多肽TAT-DV1-BH3具有明顯抑制腫瘤生長(zhǎng)的效果。
　　2.從尾靜脈將多肽注射到荷瘤裸鼠體內(nèi)，觀察到TAT-DV1-BH3組在腫瘤處大量聚集綠色熒光，而TAT-DV1和DV1-BH3在瘤塊區(qū)也有聚集少量的綠色熒光，而對(duì)照PBS組無綠色熒光出現(xiàn)，結(jié)果表明多

19、肽在裸鼠體內(nèi)的腫瘤具有特異性的靶向性
　　3.切片HE染色結(jié)果確認(rèn)融合多肽TAT-DV1-BH3組肝臟轉(zhuǎn)移瘤灶比其他三組少。
　　[結(jié)論]：
　　1.融合多肽TAT-DV1-BH3具有明顯抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用，兩條多肽DV1-BH3和DV1-TAT都不具有抑制腫瘤生長(zhǎng)的效果。
　　2.多肽在裸鼠體內(nèi)的腫瘤具有特異性的靶向性。
　　3.TAT-DV1-BH3融合多肽具有抗腫瘤轉(zhuǎn)移的功能，對(duì)照多肽DV1-BH3、