靶向Chk2逆轉(zhuǎn)乳腺癌干細(xì)胞化療耐藥的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景：乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，近年來其發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。化療耐藥是晚期患者治療失敗的主要原因，目前還缺乏有效的應(yīng)對(duì)手段?；熌退幍臋C(jī)制非常復(fù)雜，其中腫瘤干細(xì)胞導(dǎo)致化療耐藥是近年來研究的熱點(diǎn)。 腫瘤干細(xì)胞學(xué)說認(rèn)為，腫瘤組織中存在一群比例很小但具有自我更新能力和多向分化潛能的細(xì)胞，稱之為腫瘤干細(xì)胞或腫瘤啟動(dòng)細(xì)胞(Tumor stem cells，or Tumor—Initiating cells)，是腫瘤形成的動(dòng)力和根

2、源。既往研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤干細(xì)胞對(duì)化療具有天然的耐受性。其耐藥機(jī)制尚未完全清楚，可能包括ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ATP—binding cassette)高表達(dá)、細(xì)胞處于GO期、抗凋亡能力增強(qiáng)等。既往針對(duì)一些耐藥機(jī)制所進(jìn)行的逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥的嘗試未取得令人滿意的效果，因此探索新的靶點(diǎn)和逆轉(zhuǎn)藥物是目前研究的方向。 最近的研究顯示細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)的激活和DNA損傷修復(fù)能力的增強(qiáng)可能是某些腫瘤干細(xì)胞耐藥的重要機(jī)制。化療藥物介導(dǎo)的DNA損傷激活細(xì)胞周期檢

3、查點(diǎn)Chkl(checkpoint kinase1)和Chk2(checkpoint kinase2)，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯和DNA損傷修復(fù)。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，Chk2的激活在此過程中尤為重要。因?yàn)槿橄侔└杉?xì)胞(或稱乳腺癌啟動(dòng)細(xì)胞)對(duì)化療具有耐受性，本研究探討此化療耐受性與細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)特別是Chk2的激活和DNA修復(fù)能力的增強(qiáng)是否相關(guān)。 研究目的： (1)探討乳腺癌干細(xì)胞的化療耐受性是否與Chk2異常激活相關(guān)。 (

4、2)觀察干預(yù)Chk2激活后對(duì)乳腺癌干細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)能力和化療耐受性的影響。 材料和方法： 1.材料 1) MCF—7及其耐藥株MCF—7/ADM細(xì)胞株購(gòu)于中山大學(xué)病理學(xué)教研室 2)主要試劑及儀器：1640培養(yǎng)基、DMEM—F12培養(yǎng)基、胎牛血清均來自美國(guó)Gibco公司，MTT、DMSO、Hoechst33342、Chk2 IinhibitorⅡ來自Sigma公司，阿霉素(深圳萬樂藥業(yè)公司)，兔抗人p

5、—Chk2(Thr68)(Cell Signaling Technology)，單細(xì)胞凝膠電泳試劑盒(Cell Biolab)，F(xiàn)ACSAsia流式細(xì)胞儀(美國(guó)Becton Dickinson)，Wellscan MK3酶標(biāo)儀(Labsystem Dragon，美國(guó))，CO2恒溫培養(yǎng)箱(意大利 JOUAN公司)。 2.方法 用球囊培養(yǎng)、S—P(Side—Population)側(cè)群分析、流式檢測(cè)CD44+CD24-細(xì)胞比例

6、3種方法檢測(cè)MCF7及MCF—7/ADM細(xì)胞株中乳腺癌干細(xì)胞的含量；MCF—7/ADM細(xì)胞株進(jìn)行懸浮培養(yǎng)獲取乳腺癌干細(xì)胞；在MCF—7/ADM球囊細(xì)胞(代表乳腺癌干細(xì)胞)和貼壁細(xì)胞(代表分化的癌細(xì)胞)中分別用MTT法、Western—blot、彗星實(shí)驗(yàn)(單細(xì)胞凝膠電泳)測(cè)定兩種細(xì)胞對(duì)阿霉素的耐受性、p—Chk2(第68位蘇氨酸殘基，Thr68)的表達(dá)、化療作用下DNA損傷及修復(fù)情況；Annexin V和7-AAD雙染法檢溯阿霉素作用下球

7、囊細(xì)胞的凋亡；Chk2抑制劑存在的情況下球囊細(xì)胞的化療耐受性、DNA損傷修復(fù)能力、凋亡情況。所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件完成。 結(jié)果： 1)MCF—7及MCF—7/ADM球囊形成率分別為1.03±0.15％和10.27±0.64％；S—P側(cè)群比例分別為0.39±0.11％和9.60±0.66％；CD44+CD24-細(xì)胞所占比例分別為3.70±0.53％和64.87±3.87％。MCF—7/ADM細(xì)胞株含有更高含

8、量的乳腺癌干細(xì)胞，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(以上p均<0.05，n=3)。 2)阿霉素濃度為1，2，5，10μg/ml時(shí)MCF—7/ADM球囊細(xì)胞的存活率明顯高于貼壁細(xì)胞(p<0.001，n=3)；在阿霉素濃度為0.05，0.5μg/ml時(shí)存活率無明顯差別(P>0.05，n=3)；在Chk2抑制劑存在時(shí)各濃度組細(xì)胞存活率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 3)MCF—7/ADM球囊細(xì)胞有明顯的p—Chk2(Thr68)表達(dá)，在化療作用下表

9、達(dá)上調(diào)；貼壁細(xì)胞在有或者沒有化療藥作用的情況下都沒有檢測(cè)到p—Chk2表達(dá)。 4)0.3μg/ml阿霉素作用24小時(shí)MCF—7/ADM球囊細(xì)胞和貼壁細(xì)胞均有明顯的DNA損傷發(fā)生(指標(biāo)為拖尾率、尾部DNA含量、尾矩)；經(jīng)過24小時(shí)修復(fù)后球囊細(xì)胞的拖尾率、尾矩兩個(gè)指標(biāo)達(dá)到空白對(duì)照水平，而貼壁細(xì)胞3個(gè)指標(biāo)均未能恢復(fù)；在Chk2抑制劑存在時(shí)球囊細(xì)胞3個(gè)指標(biāo)都不能恢復(fù)。 5)經(jīng)0.3μg/ml阿霉素作用24小時(shí)后MCF—7/ADM

10、球囊細(xì)胞的凋亡率為10.30％±0.79％；撤藥修復(fù)24小時(shí)后下降至5.93％±0.91％；在Chk2抑制劑存在時(shí)修復(fù)24小時(shí)后凋亡率上升至19.53％±2.2％，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05，n=3)。 結(jié)論： 1)MCF—7/ADM細(xì)胞株懸浮培養(yǎng)可獲取乳腺癌干細(xì)胞。 2)乳腺癌干細(xì)胞具有更強(qiáng)的化療耐受性和DNA損傷修復(fù)能力。 3)乳腺瘸干細(xì)胞的化療耐受性與Chk2的異常激活有關(guān)。