RNA干擾BCRP基因表達(dá)逆轉(zhuǎn)乳腺癌耐藥細(xì)胞MCF-7-ADR耐藥性的實驗研究.pdf

1、目的：多藥耐藥(MDR)是腫瘤的重要耐藥機制，是腫瘤化療失敗的主要原因。在人類耐藥腫瘤細(xì)胞中，幾種轉(zhuǎn)運蛋白：P-g蛋白(P-gp)、多藥耐藥相關(guān)蛋白(MRP1～7)和乳腺癌耐藥蛋白(BCRP)與MDR有關(guān)，它們?yōu)樗幬锱疟?，可以?dǎo)致胞內(nèi)的細(xì)胞毒藥物濃度降低，使腫瘤細(xì)胞對多種藥物產(chǎn)生耐藥。乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)BCRP基因則可直接導(dǎo)致細(xì)胞耐藥性的產(chǎn)生，因此，阻斷BCRP基因的達(dá)可逆轉(zhuǎn)乳腺癌耐藥細(xì)胞的耐藥性。RNA干擾(RNAi)是由雙鏈RNA(d

2、sRNA)引發(fā)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默機制(PTGS)。利用RNA干擾技術(shù)可設(shè)計出針對BCRPmRNA的SiRNA序列、阻斷基因表達(dá)、逆轉(zhuǎn)耐藥性，可望成為腫瘤基因治療的新手段。因此，設(shè)計、構(gòu)建BCRP特異的RNAi表達(dá)體系，分析表達(dá)體系對乳腺癌耐藥細(xì)胞的耐藥性的影響，對腫瘤化療提供新的途徑具有重大意義。 方法：第一部分：針對BCRPmRNA序列，設(shè)計、篩選、合成三條SiRNA相關(guān)基因片段(BCRP1，BCRP2，BCRP4)，構(gòu)建出Si

3、RNA的表達(dá)載體pGenesil-BCRP-SiRNA-EGFP,雙酶切鑒定及測序驗證插入序列的正確性；第二部分：1)脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染MCF-7/ADR細(xì)胞，G418篩選得陽性克隆。2)半定量RT-PCR和Western-Blot驗證SiRNA阻斷BCRP基因表達(dá)的效率。3)應(yīng)用MTT法分析MCF-7/ADR的IC50的變化。④篩選出最佳效率的干擾鏈。 結(jié)果：1)成功構(gòu)建出針對BCRPmRNA序列的三種SiRNA載體pGenesil

4、-BCRP1-SiRNA-EGFP,pGenesil-BCRP2-SiRNA-EGFP,pGenesil-BCRP4-SiRNA-EGFP。2)脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染MCF-7/ADR細(xì)胞，G418篩選得各自陽性克隆。3)半定量RT-PCR和Western-blot檢測各組BCRP-mRNA及BCRP蛋白的表達(dá)，各組干擾鏈的阻斷效果不一，BCRP1組的BCRP-mRNA表達(dá)抑制率為30.3％，蛋白表達(dá)抑制率為65.6％，與對照組及BCRP2，BC

5、RP4組差別有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.05)。4)MTT法分析各組IC50的變化，BCRP1組的IC50明顯低于其他組，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。 結(jié)論：1)應(yīng)用表達(dá)載體法成功構(gòu)建BCRP基因特異的SiRNA干擾表達(dá)體系pGenesil-EGFP-SiRNA。2)pGenesil-EGFP-SiRNA經(jīng)脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染入靶細(xì)胞后能夠發(fā)揮基因沉默作用，但不同鏈的干擾效果不一，以BCRP1組的干擾效果最佳。3)pGenesil-EG