中期因子蛋白對(duì)體外培養(yǎng)肺腺癌A549株MMP-9表達(dá)的影響.pdf

1、分類(lèi)號(hào)UDC碩士學(xué)位論文密級(jí)中期因子蛋白對(duì)體外培養(yǎng)肺腺癌A549細(xì)胞株MMP一9表達(dá)的影響EffectionofMidkineontheexpressionofMMP一9oflungadenocarcinomacelllineA549aninvitro作者姓名：徐玉潔學(xué)科專(zhuān)業(yè)：臨床醫(yī)學(xué)(內(nèi)科學(xué))學(xué)院(系、所)：湘雅二醫(yī)院指導(dǎo)教師：諸蘭艷副教授論文答辯日期!!：!蘭：習(xí)答辯委員會(huì)主席中南大學(xué)二。一二年五月碩士學(xué)位論文中文摘要摘要目的：以人

2、肺腺癌A。。。細(xì)胞株作為研究對(duì)象(以下簡(jiǎn)稱(chēng)A瑚細(xì)胞)，觀察不同濃度中期因子蛋白(MK)干預(yù)A。。。細(xì)胞株MMP一9的表達(dá)變化，探討MK與刪P一9在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中是否相關(guān)，進(jìn)一步探討MK促進(jìn)肺癌侵襲和轉(zhuǎn)移的可能作用機(jī)制。方法：(1)MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MK對(duì)A。。。細(xì)胞增殖的作用設(shè)空白對(duì)照組及2ng／mL、lOng／mL、50ng／mL和250ng／mLMK蛋白干預(yù)組，對(duì)照組僅加等量的1640培養(yǎng)液，各濃度復(fù)3孔。每隔2d更換含同樣藥物濃度的新

3、鮮培養(yǎng)液，培養(yǎng)l～8天，加入MTT繼續(xù)孵育4h后，用酶標(biāo)儀測(cè)490nm吸光度(A)值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。(2)半定量逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶聯(lián)反應(yīng)(RTPCR)檢測(cè)塒P一9mRNA的表達(dá)設(shè)對(duì)照組及2ng／mL、lOng／mL、50ng／mL和250ng／mLMK蛋白干預(yù)組。MK蛋白作用7天后收集細(xì)胞，抽提細(xì)胞總RNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增。MMP一9擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)，其擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為320bp，以GAPDH為內(nèi)參照，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)，長(zhǎng)度450bp，實(shí)

4、驗(yàn)重復(fù)3次。(3)免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)姍P一9蛋白的表達(dá)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液后，以2500個(gè)／孔接種于24孔板上，每孔體積500ul。8h貼壁后加入含MK蛋白的1640培養(yǎng)基，使終濃度為2ng／mL、lOng／mL、50ng／mL和250ng／mL，對(duì)照組僅加等量的培養(yǎng)液。每組復(fù)3孔。干預(yù)滿7天后，加入4％多聚甲醛固定。一抗稀釋比例為1：100，4。C孵育過(guò)夜。然后按照免疫組化試劑盒規(guī)定的步驟進(jìn)行，在200倍和400倍高倍

5、鏡下觀察拍照，隨機(jī)選攝5個(gè)視野／孔，用圖像分析系統(tǒng)觀察分析。結(jié)果：1MTT檢測(cè)MK對(duì)A。。。細(xì)胞促增殖的作用：用MTT法檢測(cè)不同作用時(shí)間、不同作用濃度的MK干預(yù)A。。。細(xì)胞后的促增殖作用用不同濃度MK(Ong／ml、2ng／ml、lOng／ml、50ng／ml、250ng／m1)作用于AⅢ細(xì)胞1～8d后，用MTT比色法測(cè)得的各組OD㈣nm值(A值)，并繪制生長(zhǎng)曲線圖。不同濃度MK干預(yù)A啪細(xì)胞后其生長(zhǎng)曲線具有相同的趨勢(shì)，各干預(yù)組自第3天起