miR-339表達對肺腺癌A549細胞生物學(xué)行為的影響.pdf

1、目的:
　　肺癌是目前是全世界腫瘤性疾病死亡率的主要原因，每年可造成多于150萬人死亡。目前多數(shù)肺癌患者明確診斷時已是晚期，臨床癥狀不明顯、早期診斷困難，組織學(xué)亞型不同、對腫瘤生物學(xué)特征的認(rèn)識不足導(dǎo)致了肺癌的預(yù)后不良及高死亡率。雖然新的分子靶向治療對于某些類型的肺癌的療效表現(xiàn)出非常可觀的前景，但目前還沒有適用于大規(guī)模的肺癌病人的靶向治療。總體來說，肺癌的總體生存率依然不容樂觀，很多患者明確診斷后生存期僅僅短短數(shù)月。因此，尋找新型肺

2、癌診斷相關(guān)的腫瘤標(biāo)記物或新的治療策略對于肺癌的控制顯得至關(guān)重要。
　　目前多數(shù)研究者認(rèn)為腫瘤的生長必須依靠新生血管的生成來提供其足夠的氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)，因此以抗腫瘤血管為主的治療成為腫瘤臨床治療的熱點，血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)被認(rèn)為可作用于血管內(nèi)皮細胞，誘導(dǎo)體內(nèi)新生血管生成。抑制VEGF的作用也成為了抑制腫瘤生長的臨床研究基礎(chǔ)。當(dāng)VEGF與特異性的VEGF受體

3、結(jié)合后，會發(fā)生一系列的生物效應(yīng)，能促進血管內(nèi)皮細胞增殖誘導(dǎo)新血管的生成;增加血管通透性;改變血管內(nèi)皮細胞的基因及其表達，利于新血管的形成。本研究通過miRNA的靶基因預(yù)測數(shù)據(jù)庫對miR-339的靶基因進行預(yù)測，對3種靶基因預(yù)測數(shù)據(jù)庫所預(yù)測的靶基因交集進行功能分析，最終篩選出VEGF作為miR-339的靶基因進行研究。
　　本課題分為三個部分:第一部分通過qRT-PCR及Western blot方法分析41例肺腺癌組織中miR-33

4、9和VEGF的表達水平;第二部分采用慢病毒載體技術(shù)，建立穩(wěn)定高表達miR-339的肺腺癌A549細胞株，研究體內(nèi)外上調(diào)miR-339表達對肺腺癌A549細胞增殖、侵襲、化療敏感性及血管生成的影響;第三部分通過雙熒光素酶報告實驗及Restore實驗進一步研究miR-339對VEGF轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控機制。
　　第一部分:41例肺腺癌組織中miR-339和VEGF的表達水平分析
　　方法:
　　1.收集41例肺腺癌組織與相應(yīng)配對

5、的癌旁正常組織標(biāo)本。
　　2.運用qRT-PCR技術(shù)檢測41例標(biāo)本中miR-339及VEGFmRNA的表達水平，Spearman相關(guān)分析對二者的相關(guān)性進行分析;Western blot方法檢測41例標(biāo)本中VEGF蛋白表達水平。
　　3.分析miR-339與VEGFmRNA在不同年齡、性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、分化程度、TNM分期病例之間是否存在差異。
　　4.統(tǒng)計學(xué)方法:本研究數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS21.0軟件進行統(tǒng)計分析，符合

6、正態(tài)分布的數(shù)據(jù)表示;單因素方差分析用于同時具備正態(tài)性及方差齊性數(shù)據(jù)的多項指標(biāo)間的比較，LSD-t檢驗用于多組數(shù)據(jù)的兩兩比較;t檢驗用于兩獨立樣本計量資料的比較，配對t檢驗用于兩配對樣本計量資料的比較; Spearman相關(guān)分析用于兩組數(shù)據(jù)資料的相關(guān)性分析，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。
　　結(jié)果:
　　1.miR-339在肺癌組織中的表達約為癌旁正常組織的1/3，而VEGFmRNA的表達水平是癌旁正常組織的3倍，二者的表達水平之間存

7、在負相關(guān)性(r=-0.419，P=0.006)。
　　2.miR-339及VEGFmRNA在不同TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況的肺腺癌組織中表達水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　第二部分:上調(diào)miR-339表達對肺腺癌A549細胞增殖、侵襲、化療敏感性及血管生成的影響
　　方法:
　　1.制備和包裝miR-339及無關(guān)序列慢病毒表達載體，感染肺腺癌A549細胞，建立穩(wěn)定高表達miR-339的肺腺癌A549細

8、胞株，實驗分miR-339組，NC組，Blank組。
　　2.qRT-PCR檢測三組細胞miR-339及VEGFmRNA表達，Western blot檢測VEGF蛋白及侵襲相關(guān)蛋白MMP2、MMP9表達。
　　3.CCK-8、克隆形成實驗檢測三組細胞的增殖能力。
　　4.Transwell小室檢測三組細胞的侵襲能力。
　　5.CCK-8檢測不同濃度順鉑作用下三組細胞的增殖能力。
　　6.建立裸鼠移植瘤模型，

9、應(yīng)用小動物活體成像儀檢測三組裸鼠瘤體的增殖情況。
　　7.小動物活體成像儀檢測順鉑作用下裸鼠瘤體的增殖情況。
　　8.免疫組化技術(shù)檢測移植瘤標(biāo)本的微血管密度變化。
　　9.采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。
　　結(jié)果:
　　1.成功制備miR-339及無關(guān)序列重組慢病毒載體，二者重組慢病毒滴度分別為1.6×108TU/mL及2.2×108TU/mL。miR-339在miR-33

10、9組表達水平明顯高于NC組及Blank組(P＜0.05)。
　　2.miR-339組VEGFmRNA表達水平明顯低于NC組及Blank組，Westren blot顯示miR-339組VEGF、MMP2、MMP9蛋白表達較NC組、Blank組明顯降低(P＜0.05)。
　　3.CCK-8結(jié)果顯示，miR-339組細胞的吸光度值在24h，48h，72h較Blank組及NC組明顯降低，且隨時間延長，其差異呈增大趨勢(P＜0.05)

11、。
　　4.克隆形成實驗顯示，miR-339組克隆形成數(shù)較NC組及Blank組明顯減少(P＜0.05)。
　　5.Transwell小室結(jié)果顯示，miR-339組細胞transwell穿膜細胞數(shù)較NC組及Blank組明顯減少(P＜0.05)，Blank組及NC組之間穿膜細胞數(shù)無明顯差異（P＞0.05）。
　　6.CCK-8檢測0μ g/mL，4μg/mL，8μg/mL，12μg/mL，16μg/mL，20μg/mL濃度

12、順鉑作用24小時的吸光度值，結(jié)果顯示，三組細胞的細胞活力隨順鉑濃度升高而降低(P＜0.05); miR-339組細胞在順鉑作用下細胞活力降低程度較NC組及Blank組細胞更大，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　7.小動物活體成像系統(tǒng)檢測裸鼠移植瘤體內(nèi)增殖結(jié)果顯示，從第2周起，miR-339組裸鼠移植瘤熒光信號較Blank組及NC組均明顯降低(P＜0.05)，且隨時間延長，miR-339組瘤體與Blank組及NC組熒光信號差

13、異愈加顯著(P＜0.05)。
　　8.順鉑作用下miR-339組裸鼠移植瘤熒光信號較Blank組及NC組均明顯降低(P＜0.05)，三組裸鼠移植瘤順鉑組的熒光信號均較無順鉑組降低(P＜0.05)，其中miR-339組在順鉑作用下熒光信號下降程度較Blank組及NC組更加顯著(P＜0.05)。
　　9.miR-339組裸鼠移植瘤標(biāo)本微血管密度較Blank組及NC組相比均明顯降低（P＜0.05）。
　　第三部分:miR-3

14、39對VEGF轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機理的研究
　　方法:
　　1.運用miRNA的靶基因預(yù)測數(shù)據(jù)庫對miR-339的靶基因進行預(yù)測。
　　2.構(gòu)建pmirGLO-Wt（野生型）及pmirGLO-Mt（seed region突變型）熒光素酶雙報告基因載體，分組轉(zhuǎn)染A549細胞，雙報告基因驗證miR-339的靶基因。
　　3.構(gòu)建不含3' UTR VEGF的pcDNA3.1-VEGF表達載體，分別單獨轉(zhuǎn)染、與miR-339mi

15、mics共轉(zhuǎn)染A549細胞，Western blot方法檢測各組細胞VEGF表達情況，Transwell小室檢測各組細胞侵襲能力，restore方法分析miR-339對VEGF的調(diào)控機制。
　　4.采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。
　　結(jié)果:
　　1.通過數(shù)據(jù)庫預(yù)測VEGF可能為miRNA的靶基因，二者之間存在互補配對的“seed region”區(qū)，成功構(gòu)建pmirGLO-Wt及pmirGLO-Mt報告基因重

16、組載體，并轉(zhuǎn)染A549細胞。
　　2.雙熒光素酶報告實驗顯示miR-339mimics、pmirGLO-Wt共轉(zhuǎn)染組細胞的熒光素酶活性較miR-339scramble、pmirGLO-Wt共轉(zhuǎn)染組及miR-339mimics、pmirGLO-Mt共轉(zhuǎn)染組明顯降低，miR-339可作用于VEGF3'UTR區(qū)并產(chǎn)生負調(diào)控作用使其表達降低。
　　3.成功構(gòu)建不含VEGF3'UTR的pcDNA3.1-VEGF重組表達載體，Resto

17、re實驗顯示，將不含VEGF3'UTR的pcDNA3.1-VEGF重組載體轉(zhuǎn)染至A549細胞后，可回復(fù)上調(diào)miR-339對VEGF蛋白表達的抑制作用及miR-339對A549細胞的侵襲抑制作用。
　　結(jié)論:
　　1.miR-339在肺腺癌組織中呈低表達，VEGF在肺癌組織中呈高表達，二者之間存在負相關(guān)，miR-339及VEGF表達水平在不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及不同TNM分期之間存在差異。
　　2.體外上調(diào)miR-339表達