肺腺癌A549細(xì)胞放射生物學(xué)效應(yīng)及線粒體DNA基因差異表達(dá)研究.pdf

1、目的:放射治療目前仍為肺腺癌治療的主要手段之一。DNA是輻射誘導(dǎo)增殖細(xì)胞死亡的主要靶點，線粒體DNA(mitochondrialDNA，mtDNA)作為惟一的核外遺傳物質(zhì)，其編碼基因參與細(xì)胞氧化磷酸化(oxidativephosphorization，OXPHOS)和能量代謝，與細(xì)胞的存亡息息相關(guān)。因此，探討肺腺癌細(xì)胞放射生物學(xué)效應(yīng)與其mtDNA基因表達(dá)變化的相關(guān)性，可為進(jìn)一步闡明肺腺癌放射治療機(jī)制提供實驗依據(jù)。 方法:以人肺腺

2、癌A549細(xì)胞系為研究對象，未予射線照射的同步培養(yǎng)細(xì)胞為對照，設(shè)計兩組實驗：(1)8MVX線分別以2Gy、4Gy、6Gy、8Gy的吸收劑量照射A549細(xì)胞，照射后培養(yǎng)24h；(2)8MVX線以4Gy吸收劑量照射A549細(xì)胞，照射后分別培養(yǎng)12h、24h、48h、72h。MTT法測定細(xì)胞增殖狀態(tài)，繪制不同劑量照射后細(xì)胞的增殖曲線；以流式細(xì)胞技術(shù)檢測照射后不同劑量點及時間點的細(xì)胞周期分布變化及凋亡率；電鏡下觀察照射前后細(xì)胞形態(tài)變化；提取對照

3、組、照射后不同劑量點及時間點的A549細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄熒光標(biāo)記，用人mtDNA基因表達(dá)譜芯片平行檢測26個靶基因的差異表達(dá)，GenPixPro芯片圖像分析軟件進(jìn)行基因差異的統(tǒng)計學(xué)分析。 結(jié)果:8MVX線不同劑量照射后A549細(xì)胞均出現(xiàn)增殖抑制，4Gy照射后抑制較顯著。 透射電鏡觀察顯示，X線照射后部分A549細(xì)胞可見凋亡的形態(tài)學(xué)特征，如細(xì)胞體積變小，染色質(zhì)濃集致密、邊集或碎裂成不規(guī)則塊狀，細(xì)胞質(zhì)密度升高，胞漿空泡化，

4、核膜完整等。 2Gy、4Gy、6Gy、8GyX線照射后培養(yǎng)24h，A549細(xì)胞普遍表現(xiàn)為S期細(xì)胞百分率下降，而且隨著劑量的增加，凋亡率增加，6Gy和8Gy劑量組表現(xiàn)G2/M期阻滯，4Gy為G2/M期阻滯增加并伴隨凋亡率增加的劑量效應(yīng)拐點；4GyX線照射后培養(yǎng)12h即可觀察到G2/M期的阻滯，在12h～24h阻滯“崩潰”，細(xì)胞被“釋放”，再度進(jìn)入細(xì)胞周期，培養(yǎng)72h的細(xì)胞周期分布基本接近未照射組，在照射早期隨培養(yǎng)時間延長凋亡率表現(xiàn)

5、為增長趨勢，48h為最高，達(dá)到10.14％。 不同劑量X線照射后A549細(xì)胞的mtDNA基因差異表達(dá)：2GyX線照射后培養(yǎng)24h，mtDNAtRNA-ASP、tRNA-HIS、tRNA-GLU基因表達(dá)顯著下調(diào)；4GyX線照射后培養(yǎng)24h，mtDNAtRNA-HIS、tRNA-GLU、ND1、ND2、ND3、ATPase6基因表達(dá)顯著下調(diào)；6GyX線照射后培養(yǎng)24h，mtDNAtRNA-GLU、tRNA-HIS、tRNA-ASN、

6、tRNA-CYS、tRNA-ALA、tRNA-SER及16SrRNA基因表達(dá)顯著下調(diào)；8GyX線照射后培養(yǎng)24h，mtDNAtRNA-HIS、tRNA-GLU基因表達(dá)顯著下調(diào)。 4GyX線照射A549細(xì)胞后不同時間mtDNA基因的差異表達(dá)：照射后培養(yǎng)12h，mtDNAtRNA-HIS、ND1、ND2、ND4L及ND5基因表達(dá)顯著下調(diào)；照射后培養(yǎng)24h，mtDNA16SrRNA、ND1、ND2、ND4、ND4L、COXⅠ、COXⅡ

7、、COXⅢ、ATPase6及ATPase8基因表達(dá)顯著下調(diào)；照射后培養(yǎng)48h，mtDNA編碼的13個多肽基因，2個rRNA基因，tRNA-ALA、tRNA-ASP、tRNA-ARG、tRNA-HIS基因表達(dá)均顯著下調(diào)；照射后培養(yǎng)72h，mtDNA編碼的11個多肽基因(COXⅠ及Cytb基因除外)，2個rRNA基因表達(dá)顯著下調(diào)。 結(jié)論:不同劑量X線照射A549細(xì)胞的早期(12h～48h)，主要誘導(dǎo)G2/M期阻滯，隨后阻滯逐步解除，