miR-18a對肺腺癌A549細(xì)胞放射增敏作用及分子機(jī)制研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、背景及目的:
  肺癌是世界范圍內(nèi)最常見的腫瘤。據(jù)統(tǒng)計,僅2008年就有161萬新增病例,其中約80%為非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)。雖然手術(shù)仍然是NSCLC的首選治療方法,但其確診時大多數(shù)已處于中晚期,只有少部分患者可以得到手術(shù)根治,約70%的NSCLC患者在整個治療過程中需要接受放療。然而,臨床上不少患者接受放療后出現(xiàn)復(fù)發(fā),最終導(dǎo)致患者死亡。究其原因,肺癌細(xì)胞對放射線抗拒起重

2、要作用。因此,深入研究放射耐受產(chǎn)生的機(jī)制,探尋潛在的干預(yù)靶點,對于提高放療的治療效果,改善肺癌預(yù)后具有重要意義。
  現(xiàn)已明確,放化療耐受是腫瘤干細(xì)胞的特征之一。而其中具有廣泛基因調(diào)控作用的微小RNA(microRNA,miR)的變化及其意義,更是目前研究的熱點。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),A549肺腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞與普通A549細(xì)胞相比,miR-18a水平降低。由此可以推測,miR-18a下調(diào)可能和肺腺癌細(xì)胞照射耐受有關(guān),但其具體作用

3、機(jī)制并不明了。晚近研究表明,共濟(jì)失調(diào)-毛細(xì)血管擴(kuò)張癥突變基因(Ataxia-telangiectasia mutated,ATM)在DNA損傷修復(fù)中起重要作用;而其3’非編碼區(qū)具有miR-18a結(jié)合位點。由此,我們可以進(jìn)一步推測:miR-18a通過ATM調(diào)控DNA損傷修復(fù),在肺腺癌A549細(xì)胞照射耐受中起重要作用。為驗證這一設(shè)想,本實驗擬先觀察A549細(xì)胞受X線照射后miR-18a的變化;然后通過轉(zhuǎn)染miR-18a模擬物,檢測其對A54

4、9細(xì)胞照射敏感性的影響;最后,檢測過表達(dá)miR-18a的A549細(xì)胞中ATM蛋白的改變,以初步闡明miR-18a在肺腺癌細(xì)胞照射耐受中調(diào)控作用的分子機(jī)制。
  材料和方法:
  1.X線照射對A549細(xì)胞miR-18a表達(dá)的影響:利用實時定量PCR(qRT-PCR)檢測A549細(xì)胞受2GyX線照射后miR-18a的變化。
  2.miR-18a對A549細(xì)胞照射敏感性的影響:以人工合成的miR-18a模擬物(mimic

5、s)轉(zhuǎn)染肺腺癌A549細(xì)胞,獲得miR-18a高表達(dá)A549細(xì)胞。通過集落形成實驗,分別檢測miR-18a高表達(dá)A549細(xì)胞受0,2,4,6,8GyX線照射后的克隆形成能力,描記細(xì)胞存活曲線并計算放療敏感性指標(biāo)(D0、Dq、SF2),判斷miR-18a對A549細(xì)胞照射敏感性的影響。
  3.miR-18a影響A549細(xì)胞照射敏感性的機(jī)制:以Western Blot檢測過表達(dá)miR-18a的A549細(xì)胞中ATM蛋白的改變,初步闡明

6、miR-18a在肺腺癌細(xì)胞照射耐受中調(diào)控作用的分子機(jī)制。
  結(jié)果:
  1.A549細(xì)胞受2GyX線照射后,從0.5小時開始,miR-18a水平降低,直至照射后4小時miR-18a仍處于低水平。以0h組作為基線水平,0.5h、1h、2h和4h組miR-18a相對量分別為0.20±0.05,0.22±0.10,0.18±0.04和0.31±0.09。與0h組比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
  2.miR-1

7、8a模擬物(mimics)成功轉(zhuǎn)染肺腺癌A549細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后miR-18a水平增高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。集落形成實驗顯示,miR-18a可以降低A549細(xì)胞2Gy時存活分?jǐn)?shù)(SF2),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。擬合劑量-存活曲線顯示:miR-18a可以降低A549細(xì)胞的D0、Dq、SF2值。
  3.半定量分析顯示,以空白對照組作為基線,過表達(dá)miR-18a組共濟(jì)失調(diào)-毛細(xì)血管擴(kuò)張癥突變基因(Ataxia-t

8、elangiectasia mutated,ATM)蛋白及其活化形式磷酸化的ATM(phospho Ser1981)水平分別降至0.68±0.12和0.48±0.05(P<0.05)。
  結(jié)論:
  1.miR-18a水平降低,可能是A549細(xì)胞受X線照射后發(fā)生耐受的一個重要原因。
  2.miR-18a主要通過下調(diào)在DNA損傷修復(fù)中起重要作用的ATM及其磷酸化活性形式ATM(phospho Ser1981)的表達(dá),

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