姜黃素對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞化療藥物的增敏效應(yīng)及其機(jī)制研究.pdf

1、目的 姜黃素(curcumin)是從中藥姜黃屬植物姜黃的根莖中提取的一種酚性色素，能夠抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，對(duì)正常組織器官無(wú)明顯毒副作用。順鉑為肺癌化療的常用藥物，姜黃素與順鉑聯(lián)用是否會(huì)增強(qiáng)順鉑對(duì)肺癌的殺傷效應(yīng)?目前尚無(wú)這方面的研究報(bào)道。線粒體是真核細(xì)胞重要的細(xì)胞器，是細(xì)胞的能量工廠，在細(xì)胞的凋亡中也起著非常重要的作用。線粒體DNA(mitochondrialDNA，mtDNA)是唯一的核外遺傳物質(zhì)，含有2個(gè)

2、rRNA基因、22種tRNA基因及線粒體氧化磷酸化所需的13種多肽基因，參與細(xì)胞氧化磷酸化和能量代謝，與細(xì)胞的存亡息息相關(guān)。本研究擬觀察姜黃素與順鉑聯(lián)合對(duì)肺癌細(xì)胞增殖的抑制作用，并深入研究mtDNA基因、核凋亡相關(guān)基因表達(dá)變化與兩藥聯(lián)合殺傷效應(yīng)之間的相關(guān)性，目的在于尋找到有效的化療增敏劑，為提高肺癌的臨床療效、減少順鉑的用量、減輕化療的毒副反應(yīng)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法 采用MTT法觀察姜黃素、順鉑及兩者聯(lián)合對(duì)A549細(xì)胞的抑

3、制作用，姜黃素單藥設(shè)6個(gè)濃度組，分別為5、10、15、20、40、80μmol/L，順鉑設(shè)5個(gè)濃度組，分別為0.25、0.5、1、2、4μg/ml。兩藥聯(lián)合取順鉑的終濃度為1μg/ml、2μg/m1分別與姜黃素5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L、20μmol/L聯(lián)合，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組，培養(yǎng)24h、48h、72h后，觀察對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響；以流式細(xì)胞技術(shù)結(jié)合PI及AnnexinV-FITC雙標(biāo)染色觀察細(xì)胞

4、的凋亡情況；倒置顯微鏡、透射電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化；提取未加藥、兩藥聯(lián)合作用6h、12h、18h、24h后A549細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄熒光標(biāo)記，用人mtDNA基因表達(dá)譜芯片檢測(cè)靶基因的差異表達(dá)，GenPixPro芯片圖像分析軟件進(jìn)行基因差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 結(jié)果 1.姜黃素、順鉑兩單藥對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞增殖的抑制作用 姜黃素、順鉑這兩種單藥均能抑制A549細(xì)胞的增殖，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，濃度的增加，對(duì)A549細(xì)胞

5、增殖的抑制作用增強(qiáng)，兩者作用于人肺腺癌A549細(xì)胞48h的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為18.40μmol/L、0.966μg/ml。 2.姜黃素與順鉑聯(lián)合對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞增殖的抑制作用 1μg/ml、2μg/ml順鉑與10μmol/L、15μmol/L、20μmol/L姜黃素聯(lián)合作用A549細(xì)胞24h、48h、72h后的抑制率顯著高于單用順鉑、姜黃素組(P＜0.05)，兩者呈現(xiàn)出相加的抗瘤效果。 3.姜黃

6、素與順鉑聯(lián)合作用人肺腺癌A549細(xì)胞后細(xì)胞凋亡率的變化 流式細(xì)胞技術(shù)結(jié)合AnnexinV-FITC及PI雙標(biāo)染色分析發(fā)現(xiàn)，未加藥、2μg/ml順鉑、15μmol/L姜黃素、2μg/ml順鉑與15μmol/L姜黃素聯(lián)合作用A549細(xì)胞24h后的凋亡率分別為0.18％、4.21％、3.45％、9.10％，從中可以看出凋亡率以兩藥聯(lián)合作用為最高。 4.姜黃素與順鉑聯(lián)合作用人肺腺癌A549細(xì)胞后細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化 透射電

7、鏡觀察顯示，2μg/ml順鉑與15μmol/L姜黃素聯(lián)合作用A549細(xì)胞24h，部分A549細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)發(fā)生了的改變，如線粒體腫脹，胞漿空泡化，此外還可見(jiàn)到部分細(xì)胞壞死。 5.姜黃素與順鉑聯(lián)合作用人肺腺癌A549細(xì)胞后細(xì)胞mtDNA基因及核凋亡基因的表達(dá)情況。 2μg/ml順鉑與15μmol/L姜黃素聯(lián)合作用A549細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)mtDNA及凋亡相關(guān)基因的差異表達(dá)：6h，12SrRNA、ND5基因表達(dá)顯著上調(diào)，ND2、

8、ND3、tRNA-SER、p53、Bax基因表達(dá)有一定程度的上調(diào)；12h，Bax基因表達(dá)顯著上調(diào)，ND3基因表達(dá)有一定程度的上調(diào)，tRNA-SER基因表達(dá)有一定程度的下調(diào)；18h，Bax、Bcl-xL基因表達(dá)顯著上調(diào)，tRNA-CYS、ND3、COXI、ND1基因表達(dá)有一定程度上調(diào)；24h，Bcl-xL、16SrRNA、ATPase6、ATPase8基因表達(dá)顯著下調(diào)，ND5基因表達(dá)有一定程度的下調(diào)，Bax基因表達(dá)顯著上調(diào)，ND3基因表達(dá)

9、有一定程度的上調(diào)。 結(jié)論 1.姜黃素、順鉑對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用，姜黃素能夠增強(qiáng)順鉑的抗腫瘤效果。 2.姜黃素、順鉑能夠誘導(dǎo)人肺腺癌A549細(xì)胞凋亡，兩者聯(lián)合誘導(dǎo)A549細(xì)凋亡效應(yīng)更強(qiáng)，具體作用機(jī)制在于姜黃素能誘導(dǎo)A549細(xì)胞Bax基因表達(dá)上調(diào)，Bcl-xL基因表達(dá)下調(diào)，使Bax/Bcl-xL比值顯著上升。 3.姜黃素與順鉑聯(lián)合作用于A549細(xì)胞后的初期階段(18h內(nèi))，mtDNA部