姜黃素對卵巢癌SKOV3-CDDP細(xì)胞化療增敏作用及其機制的研究.pdf

1、目的：通過研究探討姜黃素（Curcumin，Cur）對人卵巢癌耐藥細(xì)胞株SKOV3/CDDP體外增殖及其凋亡相關(guān)蛋白 Caspase-3、Bcl-2、Bax的表達(dá)影響,分析姜黃素對卵巢癌SKOV3/CDDP耐藥逆轉(zhuǎn)的可能機制，為中藥輔助化療劑的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　1.體外培養(yǎng)親本細(xì)胞SKOV3（人卵巢漿液性乳頭狀腺癌細(xì)胞）及其順鉑耐藥細(xì)胞SKOV3/CDDP并連續(xù)傳代，用不同濃度的順鉑（1μg/ml、2μ

2、g/ml、4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml、32μg/ml、64μg/ml）分別作用于SKOV3及SKOV3/CDDP24h,用MTS法測得SKOV3/CDDP的耐藥指數(shù)。
　　2.以不同濃度的Cur（0μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、60μmol/L、80μmol/L）分別作用于SKOV3/CDDP細(xì)胞24h、48h、72h后，以 MTS法檢測其對 SKOV3/CDDP細(xì)胞生長的影響

3、。檢測低濃度的Cur（10μmol/L）聯(lián)合順鉑較單用順鉑對細(xì)胞耐藥指數(shù)的影響，觀察 Cur是否對SKOV3/CDDP有化療增敏作用。
　　3.采用流式細(xì)胞術(shù)檢測Cur對細(xì)胞凋亡的影響，實驗分為以下四組：①對照組：僅含10％胎牛血清的DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)的SKOV3/CDDP細(xì)胞。②Cur組：10μmol/LCur作用的SKOV3/CDDP細(xì)胞。③CDDP組：3.8μg/ml順鉑作用的SKOV3/CDDP。④Cur+CD

4、DP組：10μmol/L Cur和3.8μg/ml順鉑同時作用的SKOV3/CDDP細(xì)胞。
　　4.Western-Blotting檢測以上四種分組處理后細(xì)胞的凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、Bcl-2、BAX的表達(dá)情況。
　　5.RT-qPCR檢測檢測以上四種分組處理后細(xì)胞的凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、Bcl-2、BAX的mRNA表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.不同濃度的順鉑分別作用 SKOV3及 SKOV3/

5、CDDP24h后，SKOV3/CDDP的細(xì)胞生存率明顯高于其親本細(xì)胞 SKOV3（P<0.001）， SKOV3/CDDP和SKOV3的IC50分別為31.79和3.72。耐藥指數(shù)（RI）=IC50（SKOV3/CDDP）/IC50（SKOV3）=8.54。
　　2.MTS顯示，0μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、60μmol/L、80μmo/L Cur作用24h后SKOV3/CDDP抑制率分別為

6、（0.00±6.17）%、（4.82±5.06）%、（23.15±2.56）%、（40.38±3.49）%、（57.88±1.27）%、（59.72±2.11）%（F=242.67，P＜0.001）。10μmol/L與空白對照組、60μmol/L與80μmol/L組相比無統(tǒng)計學(xué)意義，其他任意兩兩比較均有統(tǒng)計學(xué)意義。作用48h后抑制率分別為（0.00±6.48）%、（8.56±3.48）%、（35.05±4.09）%、（55.27±4.0

7、0）%、（69.42±2.05）%、（80.33±0.95）%（F=347.66， P＜0.001）任意兩兩比較均有統(tǒng)計學(xué)意義。作用72h抑制率分別為（0.00±6.19）%、（23.18±6.49）%、（45.20±3.62）%、（77.07±1.49）%、（79.79±1.52）%、（80.35±1.01）%（F=349.96，P＜0.001），40μmol/L、60μmol/L、80μmol/L三組間無差異，其余任意兩兩比較均有統(tǒng)

8、計學(xué)差異。生長抑制作用隨藥物濃度的增高和作用時間的延長而增加。當(dāng) Cur≤10μmol/L時無論作用24h、48h細(xì)胞生存率均≥90%，因此可以認(rèn)為，姜黃素在此濃度對SKOV3/CDDP細(xì)胞無細(xì)胞毒性作用，并將該劑量作為逆轉(zhuǎn)劑量。經(jīng)10μmol/L Cur和順鉑聯(lián)合作用于SKOV3/CDDP細(xì)胞48h，較單用順鉑相比，細(xì)胞生存率明顯降低，順鉑的細(xì)胞毒性作用明顯增強，SKOV3/CDDP細(xì)胞的IC50由（11.77±0.03）μg/ml下

9、降至（3.47±0.54）μg/ml（P＜0.001）。
　　3.FCM顯示，空白對照組、10μmol/LCur組、3.8μg/ml順鉑組、聯(lián)合用藥組分別作用 SKOV3/CDDP細(xì)胞48h后細(xì)胞凋亡率分別為（0.02±0.02）%、（4.45±0.83）%、（6.49±2.11）%、（21.31±3.60）%（與對照組相比P=0.01＜0.05、P=0.03＜0.05、P=0.009＜0.01），與對照組相比，10μmol/LC

10、ur單藥組或與3.8μg/ml順鉑聯(lián)合用藥組均能誘導(dǎo)增加SKOV3/CDDP細(xì)胞凋亡。且10μmol/LCur單藥組與聯(lián)合用藥組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義，兩者聯(lián)合使用時誘導(dǎo)效果更加顯著（P=0.004＜0.01）。
　　4.Western-Blotting檢測：空白對照組、10μmol/LCur、3.8μg/ml順鉑單獨及聯(lián)合用藥作用于SKOV3/CDDP細(xì)胞48h后，凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、Bax、Bcl-2的相對表達(dá)量。結(jié)

11、果顯示，聯(lián)合用藥組較空白對照組可顯著增加凋亡蛋白Caspase-3、Bax的表達(dá)（P＜0.001、P＜0.001），降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)（P＜0.001）。且聯(lián)合用藥組與3.8μg/ml順鉑組相比，同樣增加了凋亡蛋白 Caspase-3、Bax的表達(dá)（P＜0.01、P＜0.001），降低了抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)（P＜0.01）。
　　5.RT-qPCR結(jié)果顯示，空白對照組、10μmol/LCur、3.8μg/ml順鉑

12、單獨及聯(lián)合用藥作用于SKOV3/CDDP細(xì)胞48h后，聯(lián)合用藥組作用較空白對照組可增加SKOV3/CDDP細(xì)胞Caspase-3、Bax mRNA的相對表達(dá)量（P＜0.001，P＜0.01），降低Bcl-2 mRNA的相對表達(dá)量（P＜0.001）。且聯(lián)合用藥組與3.8μg/ml順鉑組相比，也同樣增加了 SKOV3/CDDP細(xì)胞Caspase-3、Bax mRNA的相對表達(dá)量（P＜0.001，P＜0.01），降低Bcl-2 mRNA的相對

13、表達(dá)量（P＜0.01）。
　　結(jié)論：
　　1.Cur明顯抑制卵巢癌SKOV3/CDDP細(xì)胞體外增殖，其抑制作用具有劑量和時間依賴性。
　　2.低劑量的Cur對卵巢癌SKOV3/CDDP細(xì)胞具有化療增敏作用，可以增強順鉑的細(xì)胞毒作用。
　　3.Cur具有誘導(dǎo)卵巢癌SKOV3/CDDP細(xì)胞凋亡的作用，且這種作用在與順鉑聯(lián)合使用時效果更好。
　　4.Cur聯(lián)合順鉑應(yīng)用于SKOV3/CDDP細(xì)胞時，可以在基因轉(zhuǎn)錄水