黃酮類化合物對乏氧卵巢癌SKOV3細胞HIF-1α表達的影響及其放射增敏作用研究.pdf

1、卵巢癌是困擾女性生殖系統(tǒng)的三大惡性實體瘤之一，其死亡率居于婦科腫瘤首位，成為女性生命健康的嚴重威脅。放療是卵巢癌除手術和化療之外的第三大治療手段，常常作為術后輔助或姑息性療法，但因不同組織來源的卵巢癌細胞對射線的敏感性有所不同，加之腫瘤細胞中乏氧細胞的存在，導致療效仍然有限。腫瘤在快速生長過程中由于氧彌散障礙、血流不暢等原因?qū)е录毎霈F(xiàn)不同程度的乏氧情況。乏氧細胞對射線有抵抗性，嚴重影響放療質(zhì)量，且與腫瘤不良預后高度相關。因此，如何提高

2、乏氧腫瘤細胞的放射敏感性成為腫瘤放射治療學長期以來的熱點課題。
　　HIF-1是哺乳動物細胞中發(fā)現(xiàn)的第一個缺氧應答因子，與腫瘤的放射敏感性密切相關。細胞受到輻照后HIF-1α調(diào)控的100余種基因被激活，這些基因涉及能量代謝、血管生成及細胞增殖、代謝、運動、自噬、凋亡等多個環(huán)節(jié)，使腫瘤細胞快速適應缺氧微環(huán)境，提高對射線的抵抗性。因此通過干預HIF-1α的活性可改善乏氧細胞的敏感性。
　　本研究在模擬乏氧條件下培養(yǎng)SKOV3細胞

3、，以乏氧SKOV3細胞為研究對象，研究染料木黃酮、白楊素、槲皮素、燈盞花素四種黃酮類化合物對乏氧SKOV3細胞的放射增敏作用，并以已上市的天然乏氧細胞增敏劑馬藺子素為陽性對照，選擇一種放射增敏作用最強的藥物，探討黃酮類化合物對HIF-1α的影響及放射增敏機制。通過這些研究為尋找乏氧腫瘤細胞放射增敏劑及腫瘤放射治療提供新的思路和方法。具體內(nèi)容如下:
　　（一）乏氧卵巢癌SKOV3細胞模型的建立及檢驗
　　本實驗用厭氧產(chǎn)氣袋法建

4、立了乏氧卵巢癌SKOV3細胞模型，并用克隆形成法、MTT法、乏氧標志物法等三種方法檢驗了該模型的可行性。結果表明三種方法各有優(yōu)缺點，但都可不同程度地證明本實驗中乏氧模型的成功建立，所得結果一致。
　?。ǘS酮類化合物對常氧及乏氧SKOV3細胞的生長抑制作用
　　本實驗采用MTT法檢測染料木黃酮、白楊素、槲皮素、燈盞花素以及陽性對照藥馬藺子素對常氧及乏氧SKOV3細胞的生長抑制作用，并篩選出無毒濃度范圍。結果表明，一定濃度范

5、圍的染料木黃酮、白楊素、槲皮素、燈盞花素、馬藺子素在常氧及乏氧條件下均對SKOV3細胞存活率產(chǎn)生抑制作用，且呈現(xiàn)濃度依賴性(P＜0.05)，常氧條件下作用72h的IC50分別為47.45μg/ml,29.15μg/ml,75.98μg/ml,148.78μg/ml,38.77μg/ml,乏氧條件下作用72h的IC50分別為45.70μg/ml，24.72μg/ml，75.68μg/ml，151.46μg/ml,33.26μg/ml。

6、r>　?。ㄈS酮類化合物對常氧及乏氧SKOV3細胞的放射增敏作用
　　選擇無毒濃度范圍內(nèi)高、中、低濃度的黃酮類化合物，采用MTT法檢測黃酮類化合物對常氧及乏氧SKOV3細胞放射敏感性的影響。結果表明，根據(jù)放射增敏比(SER)，四種黃酮類化合物及陽性對照藥馬藺子素的放射增敏作用由強到弱依次為馬藺子素＞染料木黃酮＞白楊素＞槲皮素＞燈盞花素，其中燈盞花素基本無放射增敏作用。故選擇SER最接近于馬藺子素的染料木黃酮進行放射增敏的機制研究

7、。
　?。ㄋ模S酮類化合物對乏氧SKOV3細胞HIF-1α表達及相關信號通路的影響
　　SKOV3細胞經(jīng)過乏氧處理后，用9μg/ml染料木黃酮作用24h，接受6Gy射線照射，采用免疫熒光法和Western blot檢測染料木黃酮對乏氧SKOV3細胞內(nèi)HIF-1α的表達及相關信號通路的影響。Western blot結果顯示乏氧可明顯升高SKOV3細胞內(nèi)HIF-1蛋白的水平，染料木黃酮則可抑制乏氧SKOV3細胞內(nèi)HIF-1的表達

8、，與射線聯(lián)用可進一步降低HIF-1的水平，說明染料木黃酮的放射增敏作用可能與此相關。該抑制作用可能是通過抑制HIF-1上游的Ras/Raf/MEK-1/ERK1-2信號通路和/或上調(diào)介導其進入降解途徑的p53蛋白的水平而實現(xiàn)，對上游的另一條信號通路—PI3K/Akt/mTOR通路則影響甚微。
　?。ㄎ澹S酮類化合物對乏氧SKOV3細胞放射增敏機制的研究
　　SKOV3細胞經(jīng)過乏氧處理后，用3μg/ml、9μg/ml染料木黃酮

9、作用24h，接受X射線照射，用Hoechst33342染色法檢測細胞凋亡并以熒光顯微鏡觀察，PI單染法和流式細胞術檢測細胞周期分布，用免疫熒光法和Westernblot檢測γ-H2AX蛋白表達來觀察DSB情況。
　　結果發(fā)現(xiàn)，染料木黃酮單獨使用或與射線聯(lián)用均可提高乏氧SKOV3細胞的凋亡率，且呈現(xiàn)濃度依賴性(P＜0.05);對γ-H2AX蛋白進行免疫熒光染色和Western blot實驗后，發(fā)現(xiàn)染料木黃酮可增加DNA雙鏈斷裂，抑制