槲寄生中生物堿與黃酮類化合物的提取、純化及黃酮類化合物的生物活性研究.pdf

1、槲寄生為桑寄生科(Loranthaceae)植物槲寄生(Viscum coloratum(Kom.)Nakai)的干燥莖、枝。槲寄生是我國常見的傳統(tǒng)中草藥，使用記載的歷史始于秦漢時期，古代稱桑上寄生，為《神農(nóng)本草經(jīng)》上品。但槲寄生 V.coloratum(Kom.)Nakai和桑寄生Loranthusparasiticus(L)Merr.用名較為混亂，而且由于兩者功效相似及用藥習(xí)慣的沿襲，臨床上兩者一直是混用的。從《名醫(yī)別錄》到《本草綱

2、目》的一些著作中，關(guān)于桑上寄生一項大都是指槲寄生，直至近代。《中國藥典》1985年版已將桑寄生和槲寄生分列開來，在其中僅收載槲寄生Viscum coloratum(Kom)Nakai一種。我國北方諸省產(chǎn)的槲寄生品種單一，均為藥典記載的槲寄生 Viscum coloratum(Kom.)Nakai。它是以干燥的帶葉莖枝入藥，主要功效在于祛風(fēng)濕、補肝腎、強筋骨、降血壓、安胎等。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，槲寄生具有抗腫瘤、抑菌、抗衰老以及免疫調(diào)節(jié)等功

3、效。 槲寄生的主要有效成分是黃酮類化合物，生物堿、粘毒素及凝集素等，但臨床應(yīng)用主要還是以本草或者粗提物的形式為主，影響了槲寄生的有效利用，使得我國的資源優(yōu)勢無法得到充分的發(fā)揮應(yīng)用，故提取分離純化槲寄生的有效成分并明確其化學(xué)結(jié)構(gòu)顯得尤為重要。目前，對槲寄生的研究主要集中在有關(guān)抗癌蛋白活性成分，即槲寄生毒肽和凝集素及其它們的作用機理。對槲寄生中的其它化學(xué)成分及其生物活性的研究報道比較少，到目前為止，我國北方產(chǎn)的槲寄生中的生物堿和黃酮

4、類化合物的提取、分離、純化以及產(chǎn)品活性的研究未見有系統(tǒng)的報道。因此，對我國北方產(chǎn)的槲寄生中的黃酮和生物堿等成分展開研究，旨在可豐富槲寄生的應(yīng)用范圍，為充分利用我國北方的這一豐富藥材資源，開發(fā)我國自主知識產(chǎn)權(quán)的新藥提供科學(xué)依據(jù)。 本文對槲寄生主要的活性成分黃酮及生物堿均做了較為詳細的研究，為槲寄生綜合利用和新藥開發(fā)的研究奠定了相關(guān)的理論和應(yīng)用基礎(chǔ)。主要研究內(nèi)容與所得結(jié)果如下： 1．應(yīng)用現(xiàn)代食品分析技術(shù)，對槲寄生的基本營養(yǎng)

5、成分進行了較為全面的分析。結(jié)果如下(g/100g，干重)：水分含量為9.03，灰分含量為6.07，粗纖維含量為19.65，脂肪含量為14.69，總糖含量為5.53，還原糖含量為1.98，蛋白質(zhì)含量為11.29，維生素E含量為127.63μg/g。采用ICP-AES法同時測定槲寄生的微量元素，結(jié)果表明，槲寄生中含有豐富的K、Ca元素，Na、Mg的含量也相對豐富；一次煎煮液和二次煎煮液中的微量元素含量變化不大，故就微量元素而言，完全可以只煎

6、煮一次得槲寄生煎煮液即可。 2．在對槲寄生的有效成分生物堿的研究中，采用重量法測定其含量，研究比較了酸水回流提取法、超臨界CO<,2>萃取法、超聲波輔助浸提法等不同提取方法，并對實驗條件進行了正交設(shè)計試驗優(yōu)化，結(jié)果表明：超聲波輔助浸提法中總堿的得率高于超臨界CO<,2>萃取和傳統(tǒng)的酸水提取法。通過正交試驗確定提取的最佳工藝參數(shù)為：乙醇體積分數(shù)90％，超聲時間30min，固液比1:20，總堿的提取率可達1.73％。相比之下，超聲波

7、輔助浸提的方法簡單易行，不失為一種有效的提取方法。 3．對總生物堿作了進一步分離純化的探討，與離子交換相比，大孔吸附樹脂更適合于本體系生物堿的分離與純化。通過對四種不同極性的大孔吸附樹脂的篩選，優(yōu)選出D101型大孔吸附樹脂。在優(yōu)化條件(上樣液濃度0.288mg/mL，流速控制在4BV/h和pH10)下，總生物堿吸附率可達到3.15mg/g干樹脂以上；在解吸優(yōu)化條件(乙醇/水為50/50，解吸液流速控制在2BV/h)下，總生物堿解

8、析率達到94％。 4．重點對槲寄生中主要活性成分黃酮進行了研究。采用鋁鹽顯色可見分光光度法測定其含量，回收率為99.73％。研究比較了傳統(tǒng)提取法、超臨界CO<,2>萃取法、超聲波輔助浸提法等不同提取方法對槲寄生總黃酮的提取，并進行了正交設(shè)計和二次旋轉(zhuǎn)回歸設(shè)計試驗優(yōu)化，對試驗結(jié)果進行了統(tǒng)計分析或響應(yīng)面分析，得到其最高得率和最優(yōu)條件組合。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，超聲波輔助提取優(yōu)于常規(guī)提取方法，其最佳提取條件為乙醇濃度84.72％、固液比1:3

9、2、超聲時間32.78min，在此條件下的黃酮得率為1.32％。 5．在獲取黃酮粗提液后，對其純化方法進行了探索，篩選出AB-8大孔吸附樹脂對槲寄生黃酮進行分離純化，并對AB-8樹脂解吸劑的選擇、上樣濃度和pH值、進樣速度、洗脫速度進行了研究，結(jié)果表明：當(dāng)初始樣液濃度為5.2mg/mL，pH值4左右時,以4BV40％乙醇作洗脫劑，上樣速度2BV/h，洗脫流速1BV/h為最佳純化條件。純化后的樣品純度由原來的12.16％提高到69

10、.63％，提高了5.73倍，回收率可達81.36％。 6. 經(jīng)顯色反應(yīng)和紫外光譜掃描后，初步鑒別槲寄生中黃酮類化合物的類型可能為黃酮和黃酮醇。 7．通過利用AB-8型大孔吸附樹脂對提取后的總黃酮進行分步梯度洗脫，總黃酮得到了初步的分離，10％～30％乙醇洗脫液中的化合物比較多，彼此間分離效果不佳，但40％～60％乙醇洗脫液中的化合物有所減少，且分離效果尚可。對其中40％～60％乙醇洗脫液中部分黃酮類化合物進一步分離研究，

11、采用制各型高效液相色譜，改變了兩次的流動相體系，分離得到了黃酮類化合物A和B。與其他方法相比較，省時，省力，方便快捷。該兩化合物分別經(jīng)UV、IR、<'1>H NMR/<'13>C NMR以及MS相關(guān)波譜鑒定，A為高圣草素-7-O-β-D-葡萄糖甙-4’-O-β-D-芹菜糖甙，B可能為高圣草素-7-O-β-D-葡萄糖甙。 8．通過四種不同體系(油脂過氧化、DPPH自由基、超氧陰離子、羥基自由基)研究了槲寄生黃酮的抗氧化性能。結(jié)果表

12、明：在油脂體系中，一定濃度的槲寄生黃酮提取物對豆油的抗氧化作用強于一定濃度的Vc和BHT，與增效劑檸檬酸、Vc有良好的協(xié)同作用，且Vc的增效作用強于檸檬酸；在自由基體系中，采用分光光度法和化學(xué)發(fā)光法測定了純化樣品清除 DPPH·、·OH、O<,2><'->·的能力。結(jié)果顯示，槲寄生清除自由基性能良好，清除率與濃度成正量效關(guān)系，清除能力大小關(guān)系為：DPPH·>·OH>O<,2><'->·。 9．通過高圣草素-7-O-β-D-葡萄