氯化鑭對(duì)人卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞SKOV3-DDP的耐藥逆轉(zhuǎn)作用及其機(jī)制探討.pdf

1、目的：
　　體外培養(yǎng)人卵巢癌細(xì)胞SKOV3，誘導(dǎo)篩選出順鉑耐藥細(xì)胞SKOV3/DDP。研究稀土氯化鑭對(duì)人卵巢癌DDP耐藥細(xì)胞是否有逆轉(zhuǎn)作用，并初步探討其相關(guān)機(jī)制。
　　方法：
　　1、以低濃度DDP逐漸遞增，誘導(dǎo)卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞SKOV3/DDP，倒置顯微鏡下觀察兩株細(xì)胞形態(tài)學(xué)的差別，用CCK8法測(cè)定DDP（1、2、4、6、8、16、32μg/ml）對(duì)SKOV3細(xì)胞及SKOV3/DDP細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率，分別得出IC5

2、0，計(jì)算得到耐藥細(xì)胞的耐藥指數(shù)。
　　2、CCK8法檢測(cè)以一定濃度梯度氯化鑭作用36、48h后對(duì)SKOV3/DDP細(xì)胞的增殖活力影響，并選取生長(zhǎng)抑制率小于5％濃度為相對(duì)無(wú)細(xì)胞毒性氯化鑭濃度；CCK8法檢測(cè)無(wú)細(xì)胞毒性濃度的氯化鑭與DDP（1、2、4、6、8、16、32μg/ml）聯(lián)用對(duì)SKOV3/DDP細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率，比較聯(lián)合用藥與單用DDP作用的IC50。
　　3、實(shí)驗(yàn)設(shè)四組：空白對(duì)照組、單獨(dú)氯化鑭10μg/ml組、單獨(dú)D

3、DP5μg/ml組、氯化鑭10μg/ml+DDP5μg/ml組。用克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同實(shí)驗(yàn)組SKOV3/DDP細(xì)胞的克隆形成能力，以流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同實(shí)驗(yàn)組SKOV3/DDP細(xì)胞凋亡率。Western blot檢測(cè)不同實(shí)驗(yàn)組SKOV3/DDP細(xì)胞內(nèi)Caspase-3、ERCC1蛋白的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1、成功誘導(dǎo)SKOV3耐DDP細(xì)胞，其能夠在1μg/ml DDP中生長(zhǎng)良好。SKOV3/DDP細(xì)胞較SKOV3細(xì)胞生

4、長(zhǎng)緩慢。倒置顯微鏡下觀察SKOV3細(xì)胞株形態(tài)呈鵝卵石樣，大小一致，形態(tài)規(guī)則；SKOV3/DDP細(xì)胞株呈長(zhǎng)形梭形，相對(duì)扁平，多角，折光性稍差。
　　2、SKOV3/DDP細(xì)胞相對(duì)SKOV3細(xì)胞具有一定耐藥性，耐藥指數(shù)RI為2.09倍。不同濃度DDP處理SKOV3細(xì)胞和SKOV3/DDP細(xì)胞24h，DDP對(duì)SKOV3的IC50為4.96μg/ml，對(duì)SKOV3/DDP細(xì)胞的IC50為10.37μg/ml。
　　3、氯化鑭（10~

5、320μg/ml）能抑制SKOV3/DDP細(xì)胞的體外增殖，10μg/ml氯化鑭對(duì)SKOV3/DDP生長(zhǎng)抑制率小于5%，無(wú)直接細(xì)胞毒作用，以10μg/ml氯化鑭作為后續(xù)研究耐藥逆轉(zhuǎn)的濃度；氯化鑭濃度(≤10μg/ml)時(shí)隨著時(shí)間增加抑制率上升不顯著，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在較高濃度氯化鑭作用時(shí)，呈現(xiàn)一定的濃度和時(shí)間依賴性。
　　4、10μg/ml氯化鑭和DDP聯(lián)合作用可增強(qiáng)DDP對(duì)SKOV3/DDP細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。10μg/ml氯化鑭

6、聯(lián)合不同濃度的DDP作用24h，DDP對(duì)SKOV3/DDP細(xì)胞的IC50為7.25μg/ml；而單用DDP刺激24h的IC50為10.37μg/m。
　　5、克隆形成實(shí)驗(yàn)：10μg/ml氯化鑭和DDP聯(lián)合作用能有效抑制SKOV3/DDP細(xì)胞克隆形成?？瞻讓?duì)照組、單用氯化鑭10μg/ml組、單用DDP5μg/ml組、DDP5μg/ml+氯化鑭10μg/ml組克隆形成率分別為（11.20±0.52）%、（8.73±0.50）%、（0.

7、96±0.15）%、0；且DDP5μg/ml組、DDP5μg/ml+氯化鑭10μg/ml組跟空白對(duì)照組相比SKOV3/DDP細(xì)胞量減少。
　　6、流式細(xì)胞術(shù)測(cè)細(xì)胞凋亡：10μg/ml氯化鑭和DDP聯(lián)合作用能增加SKOV3/DDP細(xì)胞凋亡?？瞻讓?duì)照組、單用氯化鑭10μg/ml組、單用DDP5μg/ml組、DDP5μg/ml+氯化鑭10μg/ml組，其凋亡率分別為19.2%、23.5%、29.1%、39.2%。單用DDP5μg/ml組

8、與空白對(duì)照組比較，凋亡率上升。單用氯化鑭10μg/ml組與空白對(duì)照組比較，凋亡率上升不明顯。DDP5μg/ml+氯化鑭10μg/ml組與單用DDP5μg/ml組比較凋亡率明顯上升。
　　7、SKOV3/DDP細(xì)胞中Caspase-3、ERCC1蛋白表達(dá)水平測(cè)定：氯化鑭10μg/ml+DDP5μg/ml聯(lián)合用藥與單獨(dú)DDP5μg/ml組比較，ERCC1蛋白表達(dá)減少，活化Caspase-3蛋白表達(dá)增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在SKOV3/

9、DDP細(xì)胞中，單用DDP5μg/ml組，ERCC1蛋白表達(dá)上調(diào)；DDP5μg/ml+氯化鑭10μg/ml組，ERCC1蛋白的表達(dá)明顯下調(diào)；兩組分別與空白對(duì)照組比較均有顯著差異（P<0.05），兩組間比較差異有顯著性（P<0.05）；單用DDP5μg/ml組，活化Caspase-3蛋白表達(dá)與空白對(duì)照組比，表達(dá)有上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；DDP5μg/ml+氯化鑭10μg/ml組，活化Caspase-3蛋白的表達(dá)明顯上調(diào)，差異

10、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）； DDP5μg/ml+氯化鑭10μg/ml組與單獨(dú)DDP組比較，活化Caspase-3蛋白的表達(dá)增加，差異有顯著性（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1、從低劑量DDP逐漸遞增能夠誘導(dǎo)具有一定耐藥性的SKOV3/DDP細(xì)胞。
　　2、一定濃度氯化鑭對(duì)SKOV3/DDP細(xì)胞有增殖抑制作用，并且低劑量無(wú)直接細(xì)胞毒性氯化鑭能夠增加SKOV3/DDP細(xì)胞對(duì)DDP的敏感性。
　　3、DDP作用