S100A4在卵巢癌順鉑耐藥中的作用.pdf

1、研究背景
　　卵巢癌是婦科常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，具有起病隱匿、易轉(zhuǎn)移、預(yù)后差等特點(diǎn)[1]。由于早期缺乏特異性的診斷手段，超過(guò)70％的卵巢癌患者就診時(shí)已有盆腔轉(zhuǎn)移或淋巴轉(zhuǎn)移，被確診為中晚期[2]。而對(duì)于中晚期及腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)后的卵巢癌患者，化療是主要的治療手段之一。盡管以鉑類為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療取得了一定的進(jìn)展，但其5年生存率仍未見(jiàn)明顯提高。順鉑是被廣泛應(yīng)用的一線化療藥物[3]，在多種實(shí)體腫瘤中均具有明顯的抗腫瘤活性。然而隨著耐藥現(xiàn)象的出

2、現(xiàn)，其療效不盡如人意。因此，尋找卵巢癌順鉑耐藥的分子靶點(diǎn)或有效的逆轉(zhuǎn)劑已經(jīng)成為當(dāng)今卵巢癌治療中亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題。
　　S100A4（S100calcium-bindingproteinA4）是鈣結(jié)合蛋白S100家族成員之一[4]。S100蛋白作為一種鈣傳感器蛋白，通過(guò)Ca2+信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞增殖分化、細(xì)胞黏附運(yùn)動(dòng)、酶的激活及細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要作用[5]。許多研究證實(shí)，S100A4在腎癌、結(jié)腸癌、胃癌、膽管癌、卵

3、巢癌等多種惡性腫瘤中呈高表達(dá)，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移及化療敏感性密切相關(guān)，并可作為判斷腫瘤復(fù)發(fā)及患者預(yù)后的有效指標(biāo)之一[6-10]。
　　那么S100A4在卵巢癌治療具有什么作用？其與順鉑耐藥性之間又具有什么關(guān)系呢？這些問(wèn)題都需要進(jìn)一步研究。
　　本研究擬以卵巢癌細(xì)胞為研究對(duì)象，采用Westernblot、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)卵巢癌細(xì)胞中S100A4的表達(dá)，并分析其與順鉑耐藥之間的關(guān)系；其次以卵巢癌順鉑

4、敏感細(xì)胞株A2780和耐藥細(xì)胞株CP70為研究對(duì)象，觀察S100A4重組質(zhì)粒及siRNA沉默S100A4基因?qū)?xì)胞順鉑敏感性的影響。本研究為S100A4參與卵巢癌順鉑耐藥的形成提供有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并為進(jìn)一步探討其在卵巢癌順鉑耐藥中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　目的
　　1.觀察S100A4在卵巢癌細(xì)胞中的表達(dá)；
　　2.觀察S100A4的表達(dá)與卵巢癌細(xì)胞順鉑耐藥的相關(guān)性；
　　3.觀察S100A4重組質(zhì)粒及S100A

5、4siRNA對(duì)卵巢癌細(xì)胞順鉑敏感性的影響，為進(jìn)一步分析S100A4成為逆轉(zhuǎn)卵巢癌順鉑耐藥的分子靶點(diǎn)提供依據(jù)。
　　方法及內(nèi)容
　　1.以卵巢癌細(xì)胞株SKOV3，順鉑敏感細(xì)胞株A2780、耐藥細(xì)胞株CP70，高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株HO-8910PM、低轉(zhuǎn)移細(xì)胞株HO-8910為研究對(duì)象，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR、WesternBlot觀察S100A4在卵巢癌細(xì)胞中的表達(dá)。
　　2.以順鉑敏感細(xì)胞株A2780和耐藥株CP70為研究對(duì)象

6、，采用免疫細(xì)胞化學(xué)法觀察S100A4在細(xì)胞中的表達(dá)及亞細(xì)胞定位；應(yīng)用MTT法檢測(cè)細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性差異；實(shí)時(shí)熒光定量PCR、WesternBlot觀察順鉑處理CP70后S100A4的表達(dá)變化，分析S100A4的表達(dá)與卵巢癌細(xì)胞順鉑耐藥的相關(guān)性。
　　3.以順鉑敏感細(xì)胞株A2780為研究對(duì)象，應(yīng)用重組DNA技術(shù)構(gòu)建重組質(zhì)粒S100A4-pEGFP-N1，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR、WesternBlot觀察轉(zhuǎn)染后S100A4的表達(dá)，MT

7、T法觀察卵巢癌細(xì)胞順鉑敏感性的變化。
　　4.以順鉑耐藥細(xì)胞株CP70為研究對(duì)象，應(yīng)用siRNA技術(shù)沉默S100A4基因，實(shí)時(shí)熒光定量PCR、WesternBlot觀察轉(zhuǎn)染后S100A4的表達(dá)，MTT法觀察S100A4siRNA對(duì)卵巢癌細(xì)胞順鉑敏感性的影響。
　　結(jié)果
　　1.在5種卵巢癌細(xì)胞株中，S100A4在順鉑耐藥細(xì)胞株CP70中的表達(dá)最高，而在敏感株A2780中表達(dá)最低；
　　2.S100A4在A2780

8、及CP70中均為胞漿表達(dá)。順鉑對(duì)A2780和CP70的IC50值分別為17.09μM和62.10μM。順鉑處理CP70細(xì)胞后，S100A4的mRNA及蛋白表達(dá)具有劑量及時(shí)間依賴性。
　　3.S100A4-pEGFP-N1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A2780細(xì)胞后，順鉑對(duì)細(xì)胞的IC50值較空白對(duì)照組的19.06μM上升至轉(zhuǎn)染組的51.09μM，對(duì)順鉑耐受性提高了2.69倍。
　　4.S100A4siRNA轉(zhuǎn)染CP70細(xì)胞后，S100A4mR

9、NA及蛋白的表達(dá)下調(diào)，順鉑對(duì)CP70細(xì)胞的IC50值較空白對(duì)照組的64.38μM下降至轉(zhuǎn)染組的38.12μM，對(duì)順鉑敏感性提高了1.69倍。
　　結(jié)論
　　1.S100A4在卵巢癌順鉑敏感細(xì)胞株A2780中呈低表達(dá)，而在耐藥細(xì)胞株CP70中呈高表達(dá)，高表達(dá)S100A4的CP70細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性顯著降低，同時(shí)順鉑可誘導(dǎo)CP70中S100A4表達(dá)的上調(diào)，且其在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮耐藥作用，提示S100A4的高表達(dá)與卵巢癌順鉑耐藥密切相