Annexin A3在穩(wěn)定培養(yǎng)卵巢癌鉑類耐藥細胞系中的表達及其對順鉑誘導的卵巢癌細胞凋亡的影響.pdf

1、研究背景和目的:
　　 卵巢癌是死亡率最高的婦科惡性腫瘤，雖經過規(guī)范化的治療，包括理想的腫瘤細胞減滅術和以鉑類和/或紫杉醇為基礎的聯合化療，晚期卵巢癌的5年生存率仍徘徊在15％—20％左右[1]，對化療藥物產生耐藥性是造成卵巢癌5年生存率得不到改善的一個重要原因。
　　 化療耐藥可分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩種。約有15％—20％的卵巢癌患者對順鉑等化療藥物原發(fā)耐藥。多數患者在接受化療的過程中逐漸產生耐藥性，臨床表現規(guī)范化療停藥

2、6個月內臨床復發(fā)、用藥期間出現部分緩解、最好的療效為穩(wěn)定等。腫瘤的耐藥現象一方面與抗腫瘤藥物的反復作用引起基因的突變或后遺傳性改變有關，另一方面也有賴于腫瘤中已經存在的耐藥細胞亞群的選擇性生長。
　　 鉑類的耐藥機制尚未明確，主要涉及以下幾個方面：1、藥物在腫瘤細胞內蓄積減少，包括細胞對藥物的攝入減少和主動外排增加；2、腫瘤細胞對抗腫瘤藥物的轉化和解毒功能增強；3、腫瘤細胞內DNA修復功能增強；4、鉑類藥物誘導腫瘤細胞凋亡的過程

3、中，細胞凋亡傳導通路上的調節(jié)蛋白的表達改變等。作為目前臨床治療卵巢癌的一線化療藥物，闡明其耐藥機制，對逆轉臨床耐藥和提高患者5年生存率具有重要的意義。
　　 2003年，本課題組受北京協和醫(yī)院重點基金資助，開展了卵巢癌耐藥相關蛋白的比較蛋白質組分析、尋找耐藥相關候選蛋白的研究。在通過體外誘導構建卵巢癌SKOV3順鉑耐藥細胞株，以及獲購卵巢癌順鉑敏感(A2780)、耐藥細胞株(A2780/CDDP)的基礎上，采用雙向電泳技術(2—

4、DE)比較卵巢癌順鉑敏感、耐藥細胞的蛋白質表達圖譜，鑒定差異表達蛋白，篩選獲得目標耐藥候選蛋白AnnexinA3。利用基因工程技術，構建含正義、反義Annexin A3序列的真核表達質粒，人為地上調或下調Annexin A3蛋白的表達水平，驗證了Annexin A3蛋白與鉑類耐藥的相關性，進而又從動物水平和人體水平進一步探討其在體內發(fā)揮耐藥功能的可能性。
　　 近期研究表明，細胞耐藥現象可能與抗癌藥物引起的細胞凋亡程序缺陷有關。

5、順鉑能夠誘導腫瘤細胞凋亡，控制細胞凋亡途徑有關的信號傳導通路、調節(jié)蛋白的異常表達可能與細胞的藥物敏感性相關。
　　 本研究在前期工作的基礎上，首先檢測了卵巢癌耐藥細胞系在體外穩(wěn)定培養(yǎng)過程中耐藥性的維持及Annexin A3蛋白的表達。采用基因工程技術，構建含正義和反義Annexin A3序列的逆轉錄病毒載體，轉染卵巢癌細胞系。進一步驗證AnnexinA3在順鉑誘導細胞凋亡通路中的可能作用機制。
　　 研究內容及方法:

6、r>　　 1、體外常規(guī)培養(yǎng)卵巢癌順鉑敏感細胞系SKOV3、A2780，以及耐藥細胞系SKOV3/CDDP、A2780/CDDP，采用MTT的方法檢測細胞的耐藥指數，并從不同時間復蘇和持續(xù)培養(yǎng)兩個不同角度探討耐藥細胞系耐藥性的維持。比較兩細胞系細胞形態(tài)(姬姆薩—瑞氏染色)、生長曲線(7天培養(yǎng)法)、生長周期(流式細胞儀檢測)等生物學特性的差異。Western blot鑒定兩細胞系Annexin A3蛋白表達的差異。
　　 2、分別

7、構建含正義、反義AnnexinA3序列的逆轉錄病毒載體，通過PCR、雙酶切、測序后基因比對鑒定重組載體。感染包裝細胞PT67，轉染NIH3T3細胞測定病毒滴度。轉染相應的腫瘤細胞，篩選陽性克隆，Western blot鑒定細胞轉染后Annexin A3表達水平的變化。擴增轉染后經篩選鑒定的陽性克隆，MTT法比較轉染前后細胞的耐藥性。比較轉染前后細胞的形態(tài)(姬姆薩—瑞氏染色)、生長曲線(7天培養(yǎng)法)、生長周期(流式細胞儀檢測)等生物學特性

8、的差異。
　　 3、順鉑作用24小時后，采用流式細胞儀分別檢測卵巢癌化療敏感、耐藥、以及轉染正義、反義AnnexinA3的細胞凋亡率。以不同濃度的順鉑作用24小時，Western blot觀察凋亡途徑上的作用蛋白Caspase3、Caspase9、Caspase8及Survivin表達水平的差異。
　　 研究結果：
　　 1、采用MTT法前后間隔5個月、分別三次測定卵巢癌耐藥細胞的耐藥指數。SKOV3/CDDP的

9、耐藥指數分別為1.844±0.37、2.18±0.19、2.07±0.57，A2780/CDDP的耐藥指數分別為2.954±0.26、3.24±0.56、2.96±0.58，RI的差異無統計學意義(P＞0.05)。耐藥細胞持續(xù)培養(yǎng)，在0week、2weeks、4weeks、6weeks、8weeks時間點檢測細胞耐藥指數，差異無統計學意義(P＞0.05)。姬姆薩±瑞氏染色結果顯示：SKOV3/CDDP細胞多核及畸形核多見，A2780/C

10、DDP部分細胞呈梭形，細胞核改變不明顯。耐藥細胞的群體倍增時間延長。耐藥細胞的細胞周期中，G0±G1期細胞比例增加，S、M期細胞比例減少，差異有統計學意義(P＜0.05)。耐藥細胞AnnexinA3表達水平增高。
　　 2、以正義、反義Annexin A3質粒為模板，行PCR增加Xho I酶切位點，瓊脂糖凝膠電泳可見1kb左右預期條帶。重組病毒載體鑒定：以菌液為模板行PCR、EcoR I、Xho I雙酶切重組載體，瓊脂糖凝膠電泳

11、可見預期條帶；用通用引物雙向測序，序列拼接后與GenBank內anx3基因cDNA比較，序列100％相符。pMSCV—sense anx3病毒滴度平均值=1.55×105CFU/mL，pMSCV—antisense anx3病毒滴度平均值=1.78×105CFU/mL。Western blot驗證轉染后細胞AnnexinA3的表達水平明顯的上調或下調。MTT法測定細胞耐藥指數，敏感細胞系在轉染。pMSCV—sense anx3后耐藥指數

12、上升約2—6倍，生長和增殖受到抑制。耐藥細胞系在轉染pMSCV—antisense anx3后耐藥指數下降約1.2—2.2倍左右，生長和增殖加快。細胞形態(tài)均無明顯改變。
　　 3、在藥物作用24h后，順鉑誘導的卵巢癌細胞開始凋亡。其中，耐藥細胞系的凋亡率明顯低于敏感細胞系。與卵巢癌化療敏感的細胞株相比，轉染正義AnnexinA3的細胞凋亡率明顯降低。與卵巢癌化療耐藥的細胞株相比，轉染反義AnnexinA3的細胞凋亡率明顯增高。卵

13、巢癌耐藥細胞系在高濃度的順鉑(60ug/ml)作用下，可以觀察到凋亡通路蛋白Caspase8、Caspase9、Caspase3的表達，Survivin的表達水平增高。轉染反義pMSCV—antisense anx3后，低濃度的順鉑即可誘導Caspase8、Caspase9、Caspase3蛋白的表達，Survivin的表達水平則降低。
　　 研究結論:
　　 1、卵巢癌順鉑敏感及耐藥細胞系SKOV3和A2780，經過長

14、期體外常規(guī)培養(yǎng)、反復凍存，其耐藥性仍能維持穩(wěn)定。與本課題前期研究的細胞相比，耐藥細胞的生物學特性無明顯的改變。本課題組誘導的SKOV3/CDDP耐藥指數較三年前有所下降，但仍良好地維持了其順鉑耐藥特性。
　　 2、采用基因工程技術分別將含正義或反義Annexin A3序列的逆轉錄病毒載體轉染卵巢癌鉑類敏感和耐藥細胞后，獲得穩(wěn)定的細胞克隆。進一步驗證了AnnexinA3蛋白與鉑類耐藥的相關性。
　　 3、Annexin A